CDKN3和FOXA1 mRNA在直肠癌中的表达关系及意义

王 凡，刘 伟，李 强，王建勋，张四新

(1.河北省唐山市协和医院普外科，河北 唐山 0630002.河北省安国市医院普外科，河北 安国 0712003.解放军陆军第82集团军医院普外科，河北 保定 071000)

直肠癌是指直肠乙状结肠交界处至齿状线之间、原发于直肠黏膜上皮的恶性肿瘤。近年来直肠癌的发病率逐年上升，且其发病有年轻化趋势。2018年全球范围内诊断为结直肠癌的患者超过180万，占所有癌种的10.2%，死亡病例超过86万，成为全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤[1]。近年来直肠癌的早期诊断方法有了提高和进步，但直肠癌早期临床症状如排便习惯、大便性状的改变相对比较隐匿，容易被患者忽视[2]，因此提高早期检测甄别技术、确定明确标志物迫在眉睫。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3(cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)为双重特异性蛋白磷酸酶家族成员，可使CDK1/2去磷酸化并失活[3]，其表达异常与多种恶性肿瘤密切相关[4]，但在直肠癌中如何表达鲜有描述。叉头框蛋白A1(fork head box protein A1，FOXA1)基因位于人染色体14q21.1站点，参与代谢过程、信号调节、细胞周期相关基因的启动，与多种肿瘤发病机制相关[5]，但FOXA1在直肠癌发病中的作用尚不明确。因此研究针对CDKN3与FOXA1 mRNA在直肠癌中表达如何这一问题探究其临床意义，以期两者可以作为直肠癌检查的辅助检查基因。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2017年11月至2020年3月在唐山市协和医院和解放军陆军第82集团军医院就诊的94例直肠癌患者作为观察组，男55例，女39例，年龄32～71岁，平均年龄(59.46±6.09)岁。另选取同时期在医院进行常规体检的健康人群95例作为对照组，男54例，女41例，年龄38～73岁，平均年龄(60.32±7.81)岁。两组性别、年龄相比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究分别经唐山市协和医院、解放军陆军第82集团军医院伦理委员会批准。按照《中国结直肠癌诊疗规范(2017年版)》结直肠癌组织学分级标准[6]，高级别直肠癌：0～49%腺管形成；低级别直肠癌：>95%腺管形成、50～95%腺管形成。其中低级别直肠癌患者36例，高级别直肠癌患者58例。按照美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)结直肠癌TNM分期系统(第七版)[7]，其中Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期49例。分化程度：中高分化51例，低分化43例。有淋巴结转移38例，无淋巴结转移56例。纳入标准：①经MRI常规检查、病理切片确诊为直肠癌患者；②在进行研究前1个月内未服用任何影响消化排泄药物；③既往无其他恶性肿瘤病史；④临床资料完整，且取得患者家属同意和配合，签署知情同意书。排除标准：①溃疡性结肠炎、结直肠息肉、直肠腺瘤；②克罗恩病、血吸虫病；③合并深静脉血栓、凝血障碍性疾病；④合并其他恶性肿瘤者；⑤合并患有心脏、肝、肾等疾病者；⑥自身免疫疾病患者。

1.2主要试剂与仪器:Trizol试剂盒、逆转录试剂盒(北京天漠科技开发有限公司，批号TR205-50、TK223-07)；实时荧光定量PCR试剂盒(杭州主诺生物技术有限公司，批号RT0418-09)；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(美国ABI公司，型号7900)。

1.3研究方法

1.3.1样品采集:所有受试人员空腹>8h，均于清晨采集静脉血3mL置于促凝试管中，4000r/min离心10min，吸取血清标本置于Eppendrof管中，于-20℃保存。

1.3.2qRT-PCR测定CDKN3与FOXA1 mRNA表达量:从-20℃取出血清样本，用Trizol试剂提取血清总RNA，异丙醇沉淀浓缩后，用75%酒精洗涤，干燥后加入100μLDEPC水，检测所得RNA纯度及完整度；按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，产物置于-20℃保存。qRT-PCR反应(反应体系20μL)：cDNA模板2 μL，10 μL2×SYBR Green PCR Master Mix，上下游引物各1 μL，DEPC水6 μL，每个样本设置3个平行。根据目的基因设计相应的上下游引物，以GAPDH为内参，引物由宝日医生物技术(北京)有限公司合成，序列见表1，反应条件：95℃ 30 s；95℃ 10 s、60℃ 90 s，45个循环。使用ΔΔCt法对结果进行相对定量分析，根据各样本平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算CDKN3与FOXA1 mRNA的相对表达量。见表1。

表1 CDKN3和FOXA1基因RT-PCR引物序列

表2 两组CDKN3 FOXA1 mRNA水平比较

2 结 果

2.1两组血清中CDKN3与FOXA1 mRNA表达比较:观察组血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表达水平明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

2.2高、低级别直肠癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表达水平比较:高级别直肠癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表达量明显高于低级别直肠癌患者(P<0.05)。见表3。

2.3CDKN3、FOXA1 mRNA与直肠癌临床病理特征的关系:将观察组血清CDKN3、FOXA1 mRNA的表达以其中位值分为两组，高于中位值者为高表达组，低于中位值者为低表达组。直肠癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表达水平与性别、年龄均无明显关系(P>0.05)，与TNM分期、分化程度和淋巴结是否转移有关(P<0.05)。见表4。

表3 高低级别直肠癌患者血清中CDKN3与FOXA1mRNA的表达

表4 直肠癌患者血清中CDKN3 FOXA1 mRNA表达与临床病理特征的关系n(%)

2.4血清中CDKN3、FOXA1 mRNA对高、低级别直肠癌患者的诊断价值:以血清中CDKN3、FOXA1 mRNA水平为检测变量绘制ROC曲线，CDKN3 mRNA诊断高、低级别直肠癌的ROC曲线下面积为0.839(95%CI：0.759～0.919)，截断值为5.317，灵敏度为63.8%，特异性为94.4%；FOXA1 mRNA诊断高、低级别直肠癌的ROC曲线下面积为0.853(95%CI：0.777～0.929)，截断值为0.740，灵敏度为70.7%，特异性为97.2%。详见图1。

图1 血清中CDKN3、FOXA1 mRNA对高、低级别直肠癌患者的诊断价值

3 讨 论

近年来，我国直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势，随着城市化进程的加速，城市地区较农村地区高发，又多因部位隐秘，患者常忽视其危险性，发现时已属于中晚期。早期直肠癌可无明显症状，但病情发展到一定程度可出现粪便性状及排便习惯改变、腹痛或腹部不适、腹部肿块、肠梗阻、贫血及全身出现消瘦、乏力、低热等症状[8]。尽管最近在治疗直肠癌的新型肿瘤药物方面取得了令人瞩目的进展，有学者认为如果直肠癌患者不进行外科手术切除，几乎不能实现治愈[9]。因此能够及早检测出直肠癌危险标志物，对于直肠癌诊治具有重要意义。

CDKN3是一种双重特异性蛋白磷酸酶，可使细胞周期蛋白依赖性激酶去磷酸化，因此作为一种细胞周期进程的关键负调控因子，其失调或突变与多种癌症有关[10,11]。如CDKN3呈高表达用于诊断宫颈癌的敏感性及特异性可分别达到93%、96%，对癌前诊断具有重要价值[12]。Chang等[13]通过研究发现，CDKN3高表达与鼻咽癌病情进展有关，可用于评估危险分层的辅助手段，也可能成为潜在治疗靶点。FOXA1是FOX家族中的一员，FoxA家族与恶性肿瘤的发生发展关系是近来研究的热点，作为转录因子与恶性肿瘤的发生、增殖、浸润及转移密切相关，在早期器官形成、机体代谢及稳态维持中具有重要作用[14]。有学者[15]经研究表明FOXA1表达可以被看成为一种肿瘤低侵袭的特征，说明FOXA1有可能成为预后的良好标志物。本研究结果显示直肠癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA表达水平明显高于对照组，推测CDKN3、FOXA1可能参与直肠癌发生、发展的过程。高级别直肠癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表达量明显高于低级别直肠癌患者，表明CDKN3、FOXA1可能促进癌细胞分化与增殖，可能用于预测直肠癌病情进展。

本研究另行二者与临床病理特征的对比，发现直肠癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA表达水平与TNM分期、分化程度和淋巴结是否转移有关，验证了二者参与直肠癌病情的发展。以血清中CDKN3、FOXA1 mRNA水平为检测变量绘制ROC曲线诊断高、低级别直肠癌的曲线下面积分别为0.839、0.853，截断值分别为5.317、0.740，灵敏度及特异性均较高，因此本研究认为CDKN3、FOXA1 mRNA对高、低级别直肠癌诊断具有一定价值，而且为进一步提高对患者的诊断准确度，临床可考虑将两者联合分析以提高效能。

综上所述，直肠癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA表达量上升，且高级别直肠癌患者二者表达量显著高于低级别直肠癌患者，CDKN3、FOXA1 mRNA参与直肠癌病情发展，对高、低级别直肠癌诊断具有一定价值。但本研究也具有一定缺陷性，如样本数过少，后期应过大样本量或扩大地域进行分析，深入探究两者在直肠癌中的作用机制，以求得到更准确的研究结果。