胡素娟,黄友光,杨 钧,贺延敏,崔 勇
银屑病是一种常见的慢性、复发性炎症性皮肤病,是一种多基因缺陷性疾病,遗传因素在银屑病发病中起重要作用[1],但其病因及发病机制尚未完全阐明。血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)基因多态性是染发皮炎的一个易感因素[2],而ACE基因多态性又与银屑病相关,尤其是东亚人[3-5]。本课题前期研究[6]显示染发可能是寻常性银屑病的发病诱因之一,而且有较多染发致敏诱发银屑病的报道[7]。近来国内外有ACE基因多态性与银屑病、ACE基因多态性与染发皮炎的关系研究,但鲜有ACE基因多态性、寻常性银屑病和染发三者的相关研究,因此开展了ACE基因插入/缺失多态性与寻常性银屑病伴染发等诱因的关系研究。
1.1.1 实验组(a) 由寻常性银屑病伴染发诱因的患者组成,共60例,其中16例有银屑病遗传史组成a1组,44例无遗传史组成a2组。男28例构成a3组,女32例构成a4组。病例来自2013年1月—2016年8月在济宁市皮肤病防治院门诊首次就诊的寻常性银屑病患者,均为汉族。实验组选择标准:①入选患者符合寻常性银屑病的诊断标准,并经2名副主任医师确诊;②病史≤2年;③均来自山东济宁市区及周边县市区;④患者之间无亲缘关系;⑤患者无心、肺、肝、肾慢性病史等重大疾病及其他皮肤病病史;⑥不限定有、无银屑病遗传史,且排除其他可能的银屑病诱因,如:环境潮湿、感染、精神紧张、吸烟、嗜酒、手术和外伤、睡眠差等[5];⑦有染发史。
1.1.2 对照1组(b) 寻常性银屑病患者,共60例,男30例,女30例,其中19例有银屑病遗传史组成b1组,41例无遗传史组成b2组。病例来源同上,病例选择标准同实验组:①~⑥,⑦无染发史。
1.1.3 对照2组(c) 选择正常人(无心、肺、肝、肾慢性病史及皮肤病等重大疾病)60例,其中男30例,女30例。选择标准:①汉族,且年龄、职业、学历与病例组无明显差异;②均来自山东济宁市区及周边县市区; ③正常个体之间无亲缘关系;④无银屑病遗传史,且排除其他可能的银屑病诱因;⑤有染发史。
1.1.4 对照3组(d) 选择正常人(无心、肺、肝、肾慢性病史及皮肤病等重大疾病)60例作为阴性对照组,其中男30例,女30例。对照选择标准同对照2组:①~④;⑤无染发史。
随机挑选符合标准的实验组和3组对照各60例成员,经知情同意后,抽取5 ml外周静脉血置于EDTA抗凝管中,-20℃条件下冷藏。采用小量全血基因组DNA提取试剂盒法进行DNA提取。ACE引物设计与合成选择第16号内含子 PH 4.3区域两侧序列合成引物,引物顺序为:上游引物 5c-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3c,下游引物 5c-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT-3c,由北 京百奥思科生物医学技术有限公司合成。聚合酶链反应(PCR)扩增参数为93.5℃,变性2 min,94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min,35个循环后72℃延伸5 min。取 PCR产物 10 µl在2 %琼脂糖凝胶上电泳(70V,40 min),应用凝胶成像系统拍照,参照DNA标准分子量特异性条带,分析图像结果。
利用SPSS13.0软件对4组研究对象的ACE基因型的统计结果应用Pearson chi-square和Fisher's exact test等卡方检验方法进行统计分析。
ACE基因的扩增的基因片段经2% 琼脂糖电泳后,ACE基因扩增产物表现为 3种ACE基因型:插入型(Ⅱ型)为490 bp扩增带,缺失型(DD型)为190 bp扩增带,杂合型(ID型)有 490 bp和 190 bp两条扩增带(图1)。
图1 ACE基因插入/缺失多态性电泳图
2.2.1 4组一般情况比较 实验组与3组对照者在年龄、性别等方面无明显差异,实验组的ACE基因型和等位基因分布频率与3组对照相比较差异无显著性(P>0.05,表1)。4组进行两两之间比较差异均无显著性,P值均>0.012。
2.2.2 实验组、对照1组中有遗传史的患者a1、b1与对照3组(d)进行比较 3组研究对象ACE基因型及等位基因分布频率差异均有统计学意义(P<0.05),其Ⅱ基因型频率和Ⅰ等位基因的频率显著升高,见表2。提示有遗传史的寻常性银屑病患者ACE基因型及等位基因分布频率与染发相关联。组间进行两两比较均无统计学意义,P值均>0.016。
表1 4组ACE基因型及等位基因分布频率比较 [例(%)]
表2 a、b组中有遗传史的成员与d组ACE基因型及等位基因分布频率比较 [例(%)]
2.2.3 实验组、对照1组中无遗传史的a2、b2与d组进行比较 3组成员ACE基因型及等位基因分布频率差异无统计学意义(P>0.05),见表3。提示无遗传史的寻常性银屑病患者ACE基因型及等位基因分布频率与染发无显著关联。
表3 a、b组中无遗传史的成员与d组ACE基因型及等位基因分布频率比较 [例(%)]
实验组(a)中有遗传史的a1和无遗传史的a2两组ACE基因型差异有统计学意义(P<0.05),提示有染发史的银屑病患者ACE基因型与遗传史有关,a1、a2的等位基因分布频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。a组在男女性别上差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。对照1组(b)中寻常性银屑病患者ACE基因型及等位基因分布频率与遗传史无显著关联(P>0.05),见表5。有染发和遗传史a1与无染发和遗传史的b2两组银屑病患者ACE基因型及等位基因分布频率比较差异均有统计学意义(P<0.05),提示寻常性银屑病患者ACE基因型及等位基因分布频率与染发、遗传史两者相关联,见表6。
表4 a组ACE基因型及等位基因分布频率关于遗传史和性别的比较 [例(%)]
表5 a2与b2组ACE基因型及等位基因分布频率关于遗传史的比较 [例(%)]
表6 a1与b2组ACE基因型及等位基因分布频率比较 [例(%)]
ACE是近年研究的热点之一,它是一种锌金属蛋白酶,几乎存在于所有人类的组织中,在皮肤主要存在于成纤维细胞、血管内皮细胞和角质形成细胞。ACE的主要功能是促进血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ,还可以降低炎性反应过程中重要递质缓激肽和物质的含量[8],从而调节皮肤的炎症反应。ACE抑制剂可以加重或诱发银屑病,其原因可能是激肽降解减少而使激肽水平增加。人类ACE基因位于染色体17q23,其16内含子有一段287 bp的DNA序列,其插入或缺失形成了ACE基因I/D多态性。研究发现ACE基因多态性是重要的遗传标志,与某些病理生理状态相关。ACE基因多态性还与高血压、冠心病、糖尿病等有关。因此在选择研究对象时排除了并发此类疾病的银屑病患者。
笔者应用 PCR技术对4组研究对象进行ACE基因I/D多态性与寻常性银屑病伴染发诱因之间的关系研究,结果显示在忽略遗传史影响的情况下,4组ACE 基因Ⅱ、ID、DD基因型分布频率及等位基因频率均无统计学差异。进一步分层研究显示ACE基因I/D多态性与伴染发诱因的寻常性银屑病患者的性别无关,而与是否有遗传史存在关联。ACE基因多态性在遗传史和染发两种诱因联合作用下变化显著,提示遗传史和染发两种诱因可能通过ACE基因 I/D多态性改变导致银屑病发生。文献报道显示有遗传史的银屑病患者中Ⅰ等位基因的频率与对照组比较显著升高[9]。本研究显示两者比较虽然有明显升高,但尚无统计学意义。而寻常性银屑病伴染发且有遗传史者与寻常性银屑病有遗传史但不伴染发者及正常人比较,ACE基因型及等位基因分布频率差异均有统计学意义,其Ⅱ基因型频率和Ⅰ等位基因的频率显著升高。研究结果存在差异与受研究对象的民族、地区、数量等差异有关。另外,银屑病是多基因遗传性皮肤病,单一或者多种易感基因、单一或者多种诱因不同组合可能在银屑病发病中发挥作用。本研究的意义在于提醒有银屑病家族遗传史的人应尽量避免染发,可以降低银屑病发生的可能性。