羊口疮病毒在羔羊4种原代细胞中的增殖特性研究

常建军，陈 曦，王天星，景 添，李瑞蕊，郭含薇，刘启龙，王 勇，李 莉，陈德坤*，文 英*

(1.青海大学农牧学院，青海西宁 810016；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

羊口疮(Orf )又称传染性脓疱(contagious ecthyma)，是一种急性、接触性的人兽共患传染病。羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)属于痘病毒科副痘病毒属，主要感染绵羊和山羊[1-2]。该病主要危害羔羊，感染的动物通常在嘴唇、蹄、乳房和外阴的皮肤上有红斑、丘疹、疖子、溃疡和疣状的厚老茧等明显临床症状，传染性极强，发病后继发葡萄球菌或链球菌等细菌感染，致死率可达90%[3-4]。羊口疮最早发现于欧洲，而后几乎所有山羊和绵羊养殖场的国家和地区均有该病发生[5-6]，我国甘肃、青海、新疆、陕西、云南等多地均有报道[7-9]。羊口疮高发季节，新生羔羊感染率可达90%[10]，感染羊只由于生产性能的下降给养羊业造成巨大的经济损失。

已有研究表明，ORFV可以在体外适宜的宿主细胞上进行增殖，其宿主范围较广。在20世纪60年代，一些学者在羊胚胎原代细胞上成功复制此病毒，但细胞病变(cytopathic effect,CPE)并不明显。此后，Sands J J等[11]和Plowright W等[12]相继在犊牛睾丸原代细胞、羔羊睾丸原代细胞上成功增殖了羊口疮病毒，并观察到了典型的细胞病变。1987年，Balassu T C等[13]研究了ORFV N27株在新生犊牛睾丸细胞上的增殖特性，结果显示病毒感染细胞之后的4 h～6 h病毒DNA开始复制，8 h～16 h病毒DNA大量聚集，25 h～30 h病毒DNA量达到稳定。Pye D[14]利用羔羊肾细胞系、Mercante M T等[15]用鸡胚成纤维细胞均成功增殖了羊口疮病毒。

目前，ORFV在各类羔羊组织原代细胞的增殖和致病变特性尚不清楚。本研究用4种羔羊原代细胞和分离纯化的ORFV FX毒株，以确定体外培养的4种羔羊原代细胞中感染ORFV的靶细胞，并比较ORFV在不同羔羊组织细胞的偏好性，以期为后续羊口疮的研究和防控提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 羔羊肾外膜上皮细胞、口唇表皮细胞、肺上皮细胞和睾丸原代细胞,均由西北农林科技大学动物医学院兽医免疫学实验室分离保存。

1.1.2 毒株 羊口疮病毒FX毒株，由西北农林科技大学兽医免疫学实验室分离鉴定[16]，置-80 ℃保存。

1.1.3 主要试剂 MEM、DMEM/F12(DF12)培养基和2× EsTaqMasterMix，北京康为生物技术有限公司产品；胎牛血清(Fatal bovine serum,FBS)，美国Sigma公司产品；DNA分子质量标准DL 2 000，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 稳压稳流电泳仪、微型水平电泳槽，北京六一生物科技有限公司产品；移液器(1 mL、100 μL、10 μL)，赛默飞世尔科技有限公司产品；冰箱，青岛海尔公司产品；电子天平，德国Sartorius公司产品；高压蒸汽灭菌锅，上海博讯有限公司设备厂产品；PCR仪，伯乐生命医学产品有限公司产品；电泳仪，上海天能科技有限公司产品；紫外凝胶成像仪，南京世研仪器设备有限公司产品；超净工作台，苏州三星净化有限公司产品；恒温培养箱，济南鑫贝西有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏与培养 将冻存的羔羊肾外膜上皮细胞、口唇表皮细胞、肺上皮细胞和睾丸原代细胞在38 ℃～42 ℃的水中快速融化，分别将细胞吸入一个T25细胞瓶内，加入10 mL FBS浓度为100 mL/L和含10 000 U青霉素和链霉素的DF12培养基(100 g/L DF12)，置于37 ℃、 体积分数为5%的CO2恒温培养箱中培养。12 h后，细胞进行全换液。48 h～72 h，待单层细胞铺满瓶底，用无菌PBS清洗3次，加入5 mg/mL的胰酶1 mL消化，轻柔晃动细胞瓶以保证胰酶均匀作用于所有细胞。在倒置显微镜下观察到细胞全部变圆时，立即加入1 mL 100 g/L DF12终止消化，轻轻拍打细胞瓶，将DF12培养基补至10 mL。按照上述步骤连续传代3次后，调整细胞密度，将细胞悬液分别转移至12孔细胞培养板和96孔细胞培养板，12孔细胞培养板每孔加1 mL细胞悬液，96孔细胞培养板每孔加100 μL细胞悬液，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养。

1.2.2 病毒复壮与接种 复苏并培养牛睾丸上皮细胞，具体操作步骤同1.2.1。向上述复壮的细胞中接种1 mL的ORFV FX株病毒液，并设加入1 mL的20 g/L MEM作为对照，放入37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内孵育60 min后，均补充20 g/L MEM至10 mL，放入37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内继续培养。当80%细胞发生病变时，将细胞瓶在-80 ℃反复冻融3次，传代至出现典型CPE。取12孔板中羔羊肾外膜上皮细胞、口唇表皮细胞、肺上皮细胞和睾丸原代细胞，弃去培养基，PBS分别清洗细胞3次，加入300 μL ORFV FX株病毒液，另设相应对照孔细胞，放入37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内孵育60 min后，补充20 g/L MEM至1 mL，放入37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内继续培养。12 h后，在倒置显微镜下观察并记录结果。

1.2.3 羊口疮病毒PCR检测方法 根据NCBI中收录的ORFV/Shanxi/2011/China参考毒株B2L全基因序列(GenBank号为：JN565696.1)，通过Primer 5.0设计ORFV B2L基因引物(表1)。引物由Invitrogen公司合成。

表1 用于扩增羊口疮病毒B2L基因的引物

取200 μL冻融3次后ORFV细胞病毒液，加入800 μL Lysis buffer，室温静置10 min，加入1.0 mL冷冻的异丙醇，-20 ℃放置5 min，14 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL 700 mL/L乙醇洗涤，14 000 r/min离心10 min，弃去乙醇晾干后，加入10 μL无菌ddH2O溶解DNA，用于PCR。PCR体系(25 μL)：2×TaqMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模版5 μL，ddH2O 6.5 μL。反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。配制20 g/L琼脂糖凝胶，取10 μL PCR产物电压100 V电泳40 min，紫外凝胶成像系统观察并记录结果。

1.2.4 病毒TCID50测定 取96孔板中羔羊肾外膜上皮细胞、口唇表皮细胞、肺上皮细胞和睾丸原代细胞，弃去培养液，PBS分别清洗细胞3次。将ORFV FX株病毒液用20 g/L MEM 通过10倍倍比梯度稀释，同时设定20 g/L MEM维持液为阴性对照和未稀释的病毒液为阳性对照，每孔加入100 μL，在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内孵育2 h后，补加100 μL维持液。每隔12 h观察细胞形态，记录细胞病变结果。按照Reed-Muench方法计算病毒的半数细胞感染量(TCID50)。

2 结果

2.1 羔羊4种组织细胞培养观察结果

肾外膜上皮细胞和睾丸原代细胞在复苏后培养至第4天，细胞铺满细胞瓶底；口唇表皮细胞培养至第6天细胞铺满瓶底；肺上皮细胞在培养至第8天后，细胞铺满瓶底。图1为羔羊不同组织细胞传代后2 d～4 d，细胞铺满细胞瓶底80%的结果，图1a为肾外膜上皮细胞，细胞界限清晰，核质均匀，呈铺路石样；图1b为口唇表皮细胞，细胞界限清晰，有上皮样细胞和成纤维样细胞；图1c为肺上皮细胞，核质清晰；图1d为睾丸原代细胞，细胞界限清晰，200倍镜下可见核透亮，细胞呈纤维状。

A.肾外膜上皮细胞; B.口唇表皮细胞; C.肺上皮细胞; D.睾丸原代细胞A.Epithelial cells of kidney outer membrane;B.Epidermal cells of lip;C.Lung epithelial cells;D.Testicular primitive cells

2.2 ORFV 在4种组织细胞上的病变观察结果

肾外膜上皮细胞，培养12 h细胞核开始浓缩，细胞质颜色加深，细胞与细胞之间的界限变得模糊；36 h开始，细胞逐渐变圆，48 h开始细胞逐渐脱落(图2)。口唇表皮细胞，12 h细胞开始收缩变圆，24 h细胞界限变得模糊，至48 h细胞收缩成团，细胞脱落明显(图3)。肺上皮细胞，36 h细胞逐渐脱落，细胞收缩变形，出现聚团(图4)。睾丸原代细胞接种ORFV后24 h细胞边界变得模糊不清，36 h细胞核质颜色加深，48 h细胞收缩变圆，细胞开始大量脱落，至72 h收毒时，70%细胞变圆，大部分细胞的细胞核凝集成一个小团，细胞出现空泡(图5)。

A.12 h;B.24 h;C.36 h;D.48 h;E.60 h;F.72 h

A.12 h;B.24 h;C.36 h;D.48 h;E.60 h;F.72 h

A.12 h;B.24 h;C.36 h;D.48 h;E.60 h;F.72 h

A.12 h;B.24 h;C.36 h;D.48 h;E.60 h;F.72 h

2.3 ORFV B2L基因PCR检测结果

4种接毒细胞PCR电泳结果显示，4种细胞的DNA提取物均在500 bp～750 bp之间出现了一条明亮的条带，结果与ORFV阳性对照一致，与预期目的片段大小560 bp结果相符(图6)。

M.DNA标准DL 2 000;1.口唇表皮细胞；2.睾丸原代细胞；3.肾外膜上皮细胞；4.肺上皮细胞；5.阳性对照；6.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000;1.Lip epithelial cell;2.Fetal sheep testicular primitive cell;3.Epithelial cell of kidney outer membrane;4.Lung epithelial cell;5.Positive control;6.Negative control

2.4 ORFV在不同细胞上感染力的测定

根据不同稀释度下每列孔内细胞的病变情况，按Reed-Muench氏法计算，得到ORFV在肾外膜上皮细胞、口唇表皮细胞、肺上皮细胞、睾丸原代细胞上的TCID50值分别是10-6.22、10-7.16、10-5.9和10-7.31。

3 讨论

迄今为止，人们探讨了羊口疮病毒在多种细胞上增殖特性。Hessami M等[17]用北美ORFV分离株shoe株接种胎牛脾细胞，发现在接种病毒12 h后，细胞培养液中可检测到病毒，36 h时，病毒滴度达到最大值，可达到1.2×108TCID50/mL。Ouyang P等[18]将ORFV接种到羔羊成纤维细胞上，观察到病毒的感染和增殖过程，显示ORFV的复制过程大致可以分为4个时期，即病毒进入期、隐蔽期、病毒形态改变与增殖期和释放期，在接种病毒后的0.5 h～1 h，病毒就能够成功吸附到细胞，病毒感染细胞约0.5 h～5 h后，会通过病毒脱壳和吞噬作用进入细胞内，在6 h～12 h时病毒的DNA会不断聚集，可检测到病毒DNA，但是细胞的状态并没有变化，15 h～18h，病毒会在细胞内不断增殖，并从感染的细胞中增殖释放，同时也在感染着新的细胞，使得病变在不断地扩大，最终可以达到一个稳定期，最后能够检测到病毒释放到细胞外。

本研究中，通过观察细胞病变过程，发现不同组织细胞在进入各个时期的时间是不同的。羊唇表皮细胞和羊睾丸原代细胞最早进入病毒增殖期，病变出现最早。不同细胞的生长状态及细胞生长的最适条件也有所不同，羊肺上皮细胞增殖速度最慢，细胞复苏后第8天才铺满细胞瓶底，而增殖速度较快的肾外膜上皮细胞、睾丸原代细胞在复苏后培养至第4天即可进行细胞传代。刚复苏的细胞状态不稳定，在调整细胞至最佳状态时才能对细胞进行病毒接种。并且，羊口疮病毒在这4种细胞的增殖速度也存在差异，这从其TCID50值就可以得到反映。

本研究证明了肾外膜上皮细胞、口唇表皮细胞、睾丸原代细胞和肺上皮细胞这4种原代细胞在ORFV作用下均能产生病变。ORFV在肾外膜上皮细胞、唇表皮细胞、肺上皮细胞和睾丸原代细胞上的TCID50值分别是10-6.22、10-7.16、10-5.9、10-7.31，这表明ORFV对4种细胞的感染力由大到小分别是睾丸原代细胞、口唇表皮细胞、肾外膜上皮细胞、肺上皮细胞。基于以上试验，我们发现在细胞水平上，ORFV能够感染以上4种细胞，这为探究未出现组织学病变的免疫机理、ORFV的致病性及病原特征提供了参考资料，也为临床上分离羊口疮病毒提供了可能的方法。