弓形虫能量代谢及营养物质的来源概述

孙洪超，付 媛，黄 靖，张红丽，石团员*

(1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所动物寄生虫病研究室，浙江杭州 310021;2.浙江省动物疫病预防控制中心，浙江杭州 310000)

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种寄生于有核细胞的顶复门原虫，生活史复杂且宿主范围广泛，可感染包括人类在内的几乎所有温血动物及鸟类。终末宿主为猫及猫科动物，卵囊随猫粪便排出体外，在适当条件下发育为有感染性的孢子化卵囊，中间宿主接触后便会造成感染，随后以迅速增殖的速殖子及缓慢增殖的缓殖子等形式存在。正常情况下人感染弓形虫不表现出明显的临床症状，但免疫低下患者如艾滋病病人感染后可出现严重症状甚至死亡。

作为单细胞真核生物，弓形虫具有多种与真核细胞类似的信号调节通路及蛋白激酶途径，以利于虫体正常生长及存活。由于其只能依靠寄生在细胞内存活，在入侵宿主细胞时，其必须具备充足的营养物质以及抵抗细胞免疫清除的能力，宿主细胞的营养代谢物质可为弓形虫增殖提供养料。真核细胞在正常生长过程中需要不断产生能量以利于细胞增殖，那么弓形虫如何获得自身生长所需能量？了解这一过程，将有助于从源头彻底切断弓形虫生长增殖，为后续开发抗弓形虫药物及疫苗提供帮助。

1 弓形虫的营养摄取方式

弓形虫速殖子及缓殖子在细胞内增殖时可不断从宿主获得营养物质，大约20 s～30 s虫体便能迅速侵入吞噬细胞，而这一过程不依赖于细胞的内吞机制。虫体进入细胞后，细胞质膜的脂质发生内陷而形成纳虫空泡(parasitophorous vacuole,PV)[1]，弓形虫在这样的“小房间”内不断生长增殖，待时机成熟便从空泡中溢出进而侵袭其他细胞。大量的虫体蛋白对纳虫空泡进行修饰，以此调控蛋白质输出以及脂质的输入。其中分子质量低于1.3 ku的蛋白均可自由进入空泡膜内，这些可以被自由穿梭的“小孔”的主要成份为弓形虫致密颗粒蛋白GRA17和GRA23[2]。这些纳虫空泡膜的孔隙对于虫体存活至关重要，是其摄取宿主代谢物的主要途径之一，同时也利于虫体自身排出有毒的代谢物如乳酸等。

2 弓形虫的糖代谢

2.1 糖酵解

顶复门寄生虫具有完整的糖酵解途径[3]、三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)过程的所有酶类及线粒体电子传递链。在植物中，糖酵解途径磷酸化中间体，如葡萄糖-6磷酸(glucose-6 phosphate)、磷酸丙糖(triose phosphate)及磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，均由一系列的磷酸转运蛋白(plastidic phosphate translocator，pPT)来运输。在拟南芥中共发现16个pPT，其中6个pPT编码功能基因[4]，疟原虫(Plasmodiumfalciparum)体内最新鉴定出5种新的假定pPT[5]，而在弓形虫(Toxoplasmagondii)及泰勒虫(Theileria)体内仅表达1种pPT，起运输糖类的作用。

弓形虫的独特之处在于其寄生在哺乳动物有核细胞中，这也决定了其特殊的代谢途径。己糖(包括葡萄糖)在细胞代谢中至关重要，对于胞内寄生虫的增殖非常关键，胞内寄生虫通过表达单一或多种糖通透酶来摄取葡萄糖。疟原虫(Plasmodium)体内介导葡萄糖转运的蛋白质是重要的药物靶标[6-7]，在利什曼原虫(Leishmania)和伊氏锥虫(Trypanosomaevansi)中葡萄糖摄取同样是维持其正常生长的先决条件[8]。弓形虫速殖子阶段主要通过糖酵解途径分解葡萄糖并获得能量，糖酵解不仅为脂肪酸合成提供碳源，同时对于驱动虫体运动并入侵细胞起重要作用[9]。弓形虫入侵或溢出的过程中，其主要能量来源在细胞质和膜之间是不断相互转移的，这利于其自身增殖。位于弓形虫质膜的黏附素促使弓形虫肌动蛋白依赖ATP聚集并介导虫体移动及入侵宿主细胞的过程，虫体蛋白MIC2通过与糖酵解途径中醛缩酶1结合进而锚定到细胞骨架上发挥作用[10]。

2.2 三羧酸循环

真核生物中线粒体是细胞的发电站，其通过三羧酸循环氧化碳水化合物、脂质及氨基酸等，从而通过电子传递链产生有效的ATP。在顶复门原虫中，管状的线粒体结构携带部分生物合成的血红素，Fe-S簇及硫辛酸(lipoic acid)补救途径等，参与多种代谢中间体的合成。但顶复门寄生虫线粒体缺少Ⅰ型NADH脱氢酶及多种参与脂肪酸β氧化过程的酶及转运体，在能量产生过程中所发挥的具体作用尚不明确。

顶复门原虫TCA过程中，负责将丙酮酸转化为乙酰辅酶A的丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)仅存在于顶质体。其中除隐孢子虫(Cryptosporidium)完全丧失TCA外，其余顶复门寄生虫的基因组注释中均显示其具有参与TCA的全套酶类。对于弓形虫来说，TCA在线粒体外同样发挥重要作用，同时葡萄糖可以为脂肪酸合酶Ⅱ(fatty acid synthase Ⅱ，FASⅡ)途径及顶质体内类异戊二醇生物合成途径提供碳源[11]。

细胞内增殖的速殖子利用来自宿主的葡萄糖及谷氨酰胺作为“原料”来完成经典的TCA。谷氨酰胺酶(glutaminase)可以通过转化为戊二酸或通过γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)分流参与TCA，其中后者主要为细胞外寄生虫存活贮存能量[12]。

3 弓形虫消化和吸收来自宿主细胞质的蛋白

弓形虫入侵宿主细胞后可形成纳虫空泡(PV)，虫体不断分泌GRA蛋白至PV，同时包括一些参与形成内部管状结构网络(intravacuolar network，IVN)的蛋白质[13]。已有报道显示IVN可从宿主细胞摄取营养物质，如脂类[14]及细胞衍生物[15]。弓形虫在PV内生长增殖过程中，其胆固醇来自于宿主细胞的供给，胆固醇转运蛋白将宿主细胞胆固醇运至纳虫空泡膜(parasitophorous vacuole membrane,PVM)，随后IVN负责将PVM上的营养物质输送至虫体，或将弓形虫的代谢物通过IVN-PVM运送至宿主细胞[16]。宿主内吞作用是沿着微管(microtubules,MTs)转移到PV的，是基于MTs的PVM内陷并被完整的输送至PV中，这一精密的过程可保证将宿主消化的一系列小分子物质成功运输至PV内。

弓形虫GRA7参与虫体获取营养的过程[17]，当弓形虫迁移至细胞核周围区域时，细胞微管组织中心(MT-organizing center,MTOC)与PVM产生联系，虫体PV陷入MTs网络中。宿主内溶酶体沿着MTs转移至PV附近，且在内化至PV之前与PVM是紧密相连的。弓形虫GRA7蛋白可以通过调控PVM收缩而隔离宿主的内溶酶体，溶酶体内的分子被水解后，便可通过载体转运蛋白穿过溶酶体膜，一旦其进入液泡腔，这些分子便可通过特异性转运蛋白被运送并穿透弓形虫质膜。

4 嘧啶及其衍生物的来源

顶复门原虫可通过简单的氨基酸如谷氨酰胺(glutamine，Gln)和天冬氨酸(aspartic acid，ASP)前体合成嘧啶。这是一个多达6步的反应过程，首先组装嘧啶衍生物乳清酸，随后加到核糖5'-磷酸上形成乳糖核苷5'磷酸，进一步通过脱羧基将其转化为单核苷酸尿苷5'-磷酸(UMP)，其为所有其他嘧啶核苷酸的前体物质。当UMP被双磷酸化为UTP后，CTP合酶(CTPs)在限速步骤中转化为CTP，这是从头合成胞嘧啶衍生物的唯一已知途径，在弓形虫体内同样存在CTP合成酶(CTPs)[18]，虫体在细胞内增殖时CTPs应具备高活性来满足核苷酸及脂质的形成。CTPs在虫体发育的所有阶段均有表达，其活性对于弓形虫的急慢性感染都很重要。嘧啶从头合成途径对于虫体的存活及生长不可或缺，是抗弓形虫药物研发的重要靶标[19]。

5 输出多种维生素作为必须酶类的辅助因子

生物素是多种羧化酶反应的辅助因子，包括乙酰辅酶A羧化酶，这对于顶质体的脂肪酸从头合成途径至关重要[20-21]。早期报道显示弓形虫体内缺乏经典的生物素合成途径，疟原虫体内的生物素连接酶主要负责修饰翻译后的乙酰辅酶A羧化酶，这对其肝脏生活史阶段非常关键[22]，随后弓形虫体内同源性的生物素才受到重视，深入探索可利于调控弓形虫的生长发育，最终试图通过抑制弓形虫的存活而起到防护作用。

6 糖酵解与弓形虫缓殖子形成

弓形虫速殖子因易于在体外进行传代培养的特点，对其相关研究较多，但在中间宿主体内，弓形虫多数情况下是以缓殖子形式存在的。缓殖子阶段虫体与宿主细胞之间是如何建立联系的？弓形虫组织包囊多存在于在脑、肌肉、眼及心脏等组织[23]，目前尚不清楚虫体是否具有特殊细胞偏好性或更喜欢长期“栖居”在某一场所。试验表明，在成纤维细胞(HFF)及骨骼肌细胞(HSKMC)中[24-25]，弓形虫期特异性分化的概率升高，这可能是因为该类非增殖细胞表达了一种特殊的未知产物或提供了特定的压力条件，但在HFF细胞蛋白质被豆蔻酸酰化后，Akt激酶被激活并通过增加葡萄糖的产量而激活糖酵解途径，进而抑制了弓形虫的分化[26]。对于增殖细胞而言，其产生大量的糖酵解中间产物及乳酸以此来维持糖酵解代谢，这个过程对于速殖子增殖较关键但不利于缓殖子的形成。一系列压力因素介导体外诱导缓殖子形成的过程，如精氨酸或碳酸氢盐的缺乏及酸碱应激等，这些因素的存在也极显著的抑制了速殖子的增殖[23]。

当抑制弓形虫营养物质的储存时，缓殖子变得较为敏感，于是其通过其他方式如自噬、脂质储存、碳水化合物储存等获取营养，缓殖子利用此方式避免虫体营养过剩。弓形虫是多种代谢缺陷型虫株，如精氨酸(arginine)、嘌呤(purine)、半胱氨酸(cysteine，Cys)等[27]，当限制这些必需因子及基础营养的供应时，弓形虫便更倾向于向缓殖子分化，利用含有少于5 μmol/L～10 μmol/L的精氨酸培养基培养弓形虫时，便会出现速殖子向缓殖子分化的现象[28]。进一步探索糖酵解及营养物质储存在缓殖子阶段的作用，将有助于揭示包囊形成过程中的营养需求，以及明确其与宿主持续性代谢的关系。

7 展望

弓形虫的代谢与顶质体关系密切，因此，顶质体相关功能基因也是目前开发抗弓形虫药物的重要靶位点。顶复门寄生虫的脂肪酸合成场所是顶质体，其中弓形虫主要依靠FASⅡ合成脂肪酸并为自身存活提供能量。因多数真核生物都是通过FASⅠ途径来合成脂肪酸并为自身供能，因此干扰弓形虫Ⅱ型脂肪酸合成途径的关键酶类，可影响弓形虫的正常生长但却不影响宿主的脂肪酸合成途径，这利于新型抗弓形虫药物靶位点的开发。

任何生物的存活均离不开能量代谢，其中三羧酸循环及β氧化过程是多数生物获得能量的主要来源[29]。糖酵解是生物体最经典的能量获取途径，弓形虫只能通过糖酵解途径获取自身存活所需的能量[30]，其中己糖激酶主要介导虫体的能量代谢。干扰弓形虫己糖激酶可导致虫体能量代谢异常，进而抑制其生长增殖[31]，因此，己糖激酶在新型抗弓形虫药物研发过程中也是重要的药物靶标。

综上所述，深入研究弓形虫的代谢途径及其关键酶类，通过干扰其关键代谢酶的合成可影响虫体正常的能量代谢，进而抑制虫体的生长及增殖，这可为新型有效抗弓形虫药物的开发提供思路。