LncRNA-ZFAS1对心肌纤维化调控作用研究

焦 磊,宫熳钰,张 莹

(哈尔滨医科大学药学院药理学教研室,黑龙江 哈尔滨 150000)

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度大于200 bp、不具有编码成熟蛋白质能力的RNA分子[1]。近年来，大量研究显示[2-3],lncRNA参与肿瘤、糖尿病、心血管疾病等多种疾病的发生发展中。锌脂蛋白编码基因Znfx1(zinc finger，NFX1-type containing 1)的反义链即锌脂蛋白反义链1(zinc finger antisense 1，lncRNA-ZFAS1)，是一种长链非编码RNA。最初，lncRNA-ZFAS1被发现对乳腺癌、结直肠癌等肿瘤具有调控作用[4-5]。我们前期研究发现，lncRNA-ZFAS1对心血管系统具有调控作用。lncRNA-ZFAS1是急性心肌梗死的外周血潜在诊断标志物[6]。深入机制研究我们发现，lncRNA-ZFAS1是肌浆网钙ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a)的内源性抑制剂，诱发心肌细胞内钙超载，从而引起心肌梗死后心脏收缩舒张功能障碍[7]。此外，我们还揭示心肌梗死后心肌细胞中lncRNA-ZFAS1的高表达会引发心肌细胞线粒体凋亡途径激活，从而诱发心肌细胞凋亡[8]。

心肌纤维化(cardiac fibrosis，CF)常常伴随病理性心肌肥厚、心肌梗死及心力衰竭等多种心血管疾病发生。心肌纤维化一旦发生难于逆转[9-10]。目前，临床上针对心肌纤维化的特异性治疗手段相对缺乏，是该领域的瓶颈问题。因此，探索心肌纤维化发生发展的关键机制，发现心肌纤维化的新靶点，并针对分子水平的新靶点提出有效的防治措施，具有重要的意义。本研究通过构建在体和离体心肌纤维化模型以及过表达lncRNA-ZFAS1转基因小鼠，探究lncRNA-ZFAS1对小鼠心肌纤维化的调控作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂阿佛丁(Avertin)购买自Sigma-Aldrich公司，货号为T48402；lncRNA-ZFAS1的siRNA(siZFAS1)：sense 5′-GCGUGAACUCCUGAGGCGAdTdT-3′和antisense 5′-UCGCCUCAGGAGUUCACGCdTdT-3′购买自广州市锐博生物科技有限公司；血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)购买自Sigma公司，货号a9525。MTT试剂购买自Sigma公司货号为M2128-100MG，引物购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物序列如下表所示。TRIzol试剂购买自Invitrogen公司，货号为15596026；逆转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit购买自TOYOBO公司，货号为fsq-101；Power SYBR Green PCR Master Mix购买自Applied Biosystems公司，货号为4364344。α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMΑ)抗体购买自Abcam公司，货号为ab7817。

Forward primer (5′-3′)LReverse primer (5′-3′)ZFAS1AGCGTTTGCTTTGTTCCCCTCCCTCGATGCCCTTCTCo1a1AAGAAGACATCCCTGAAGTCATTGTGGCAGATACAGATCAAGCo3a1TTGGGATGCAGCCACCTTGCGCAAAGGACAGATCCTGAGTGFβ1GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTATTGGTTCAGCCACTGCCGTAβ-actinACTGCCGCATCCTCTTCCTTCAACGTCACACTTCATGATGGA

1.2 仪器低温高速离心机(美国Thermo公司)；超纯水系统(美国Milipore公司)；酶标仪(瑞士Tecan公司)；Nano Drop 8000分光光度计(美国Thermo Forma公司)；逆转录仪(美国Thermo Forma公司)；实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；小动物呼吸机(UGO BASILE)；Odyssey红外荧光扫描系统(LI-COR)。

1.3 动物健康清洁级C57BL/6雄性小鼠，8周龄，体质量(25-28) g，购买自辽宁长生生物技术有限公司(NO.SCXK(辽)2020-0001)。LncRNA-ZFAS1转基因小鼠，通过CRISPR/Cas9技术在C57BL/6小鼠染色体中条件性敲入小鼠ZFAS1基因，将稳定遗传的ZFAS1敲入小鼠与工具小鼠(αMHC-Cre)杂交，最终获得心脏特异性过表达lncRNA-ZFAS1的转基因小鼠。实验动物的使用均符合哈尔滨医科大学动物伦理委员会规定。

1.4 方法

1.4.1建立小鼠心肌梗死(MI)模型 C57BL/6小鼠腹腔注射麻醉剂2%阿佛丁溶液(0.01 mL·g-1)后，固定，气管插管呼吸机，连接心电图装置，待呼吸稳定后，打开胸腔，撕开心包膜，以7/0带针缝合线结扎冠状动脉左前降支，待心尖变白，心电图(ECG)显示ST段明显太高，表明心肌梗死模型建立成功。假手术组(Sham)不结扎，其他操作与实验组相同。关闭胸腔，缝合伤口，继续饲养4周后，用于后续实验。

1.4.2Masson染色 取心肌梗死模型小鼠心脏梗死边缘区组织块，Sham组小鼠、lncRNA-ZFAS1转基因小鼠和野生型小鼠左心室心脏组织块，置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，石蜡包埋、切片，依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ20 min→二甲苯Ⅱ20 min→无水乙醇Ⅰ5 min→无水乙醇Ⅱ5 min→75%乙醇5 min梯度脱水→水洗，苏木精液染核5-10 min。用Masson丽春红酸性复红液5-10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷钼酸水溶液分化3-5 min，光绿液染5 min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。

1.4.3原代成纤维细胞培养 取1-3 d内新生C57BL/6乳鼠，75%的乙醇中消毒，采用断头法处死乳鼠后，取出心脏，剪碎心脏组织，加入胰蛋白酶消化心脏组织，用含有10%胎牛血清的高糖培养基终止消化，待所有组织块消化完毕后，1 500 r·min-1条件下离心5 min，弃去上清，用含血清的培养液重悬细胞，细胞悬液均匀铺到六孔板中，37 ℃孵箱中培养1.5 h后，成纤维细胞贴壁，弃掉悬液，加入适量的含血清培养液，培养成纤维细胞。

1.4.4细胞加药与转染 原代培养的心肌成纤维细胞贴壁后，细胞密度达70%-90%时进行加药和转染实验。实验分为对照组、加药Ang Ⅱ组(终浓度为100 nmol·L-1)、加药Ang Ⅱ后转染siZFAS1(终浓度为100 nmol·L-1)组，加药Ang Ⅱ后转染阴性对照siNC(终浓度为100 nmol·L-1)组，加药和转染48-72 h后进行后续实验。

1.4.5MTT 将加药Ang Ⅱ组和对照组心肌成纤维细胞中加入MTT溶液(0.5 mg·L-1，20 μL)，在37℃孵箱中孵育4 h后，弃去液体，每孔加入200 μL DMSO，将96孔板平放在水平摇床上10 min，用酶标仪检测在490 nm的吸光度值。

1.4.6实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 取心脏组织样本或心肌成纤维细胞，以TRIzol法提取RNA，利用Nano Drop 8 000分光光度计测定RNA浓度，按照ReverTra Ace qPCR RT Kit 试剂盒的方法将RNA逆转录成cDNA。配置SYBR Green法PCR反应体系，包括SYBR Green(10 μL)，Forward Primer(1 μL)，Reverse Primer(1 μL)，cDNA (1 μL)，Nuclease-Free Water(1 μL)。PCR反应程序为95 ℃进行10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环进行40次。采用ΔΔCt法分析Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因的表达量。

1.4.7Western blot 取心肌组织适量，加入200 μL蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂)，待心脏组织裂解充分后，12 000 r·min-1，4 ℃离心15 min，取上清液，利用BCA法测定蛋白浓度。采用SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳分离蛋白分子，基层胶：70 V，恒压30 min，待Marker各条带均分开后调电压。分离胶：110 V，待目的条带迁移到合适位置时停止电泳进行湿法转膜，冰浴300 mA恒流转膜50 min。将转膜完成的NC膜置于5%脱脂牛奶中，水平摇床室温封闭2 h。将封闭好的NC膜于PBS中清洗放入稀释好的一抗中4 ℃摇床过夜。次日将完成一抗孵育的NC膜用PBST清洗3次。于室温避光孵育荧光二抗50 min，孵育结束后NC膜用PBST避光清洗3次。利用Odessey红外成像扫描仪在红外荧光扫描系统下扫描观察NC膜，通过配套软件分析蛋白条带光密度值。

2 结果

2.1 LncRNA-ZFAS1在心肌纤维化模型小鼠心脏组织中的表达情况小鼠心肌梗死模型建立4周后，取材心脏组织进行Masson染色，结果显示，MI组小鼠心脏组织中胶原沉积显著高于假手术组(Sham)，表明在体心肌纤维化模型建立成功。取心脏组织进行qRT-PCR，结果显示，心肌纤维化模型小鼠心脏组织中lncRNA-ZFAS1的表达显著升高(Fig 1B，P<0.05)。这表明lncRNA-ZFAS1对心肌纤维化具有潜在调控作用。

Fig 1 Expression of lncRNA-ZFAS1 in cardiac tissues of mice with myocardial fibrosis

2.2 转染敲减lncRNA-ZFAS1的siRNA对心肌纤维化的影响为进一步探究lncRNA-ZFAS1对心肌纤维化的调控作用，我们构建了离体水平心肌纤维化模型。Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞中，细胞增殖显著增加(Fig 2A，P<0.01)；lncRNA-ZFAS1的表达显著升高(Fig 2B，P<0.05)。为进一步探究lncRNA-ZFAS1对心肌纤维化的影响，我们构建了敲减lncRNA-ZFAS1的siRNA(siZFAS1)。Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞中转染了siZFAS1后，lncRNA-ZFAS1的表达明显降低。转化生长因子β1(transforming growth factor beta-1，TGFβ1)和Ⅲ型胶原(collagen type III alpha 1 chain，Col3a1)是表征心肌纤维化的标志性蛋白。Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞中TGFβ1和Col3a1 的表达显著升高，敲减lncRNA-ZFAS1后，可以显著降低两者的表达(Fig 2B，P<0.05)。以上结果表明，敲减lncRNA-ZFAS1可以抑制Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化。

Fig 2 Effect of knock down lncRNA-ZFAS1 on myocardial fibrosis

2.3 过表达lncRNA-ZFAS1转基因小鼠的心肌纤维化情况为进一步探讨lncRNA-ZFAS1对心肌纤维化的影响，我们构建了心脏特异性过表达lncRNA-ZFAS1的转基因小鼠。如Fig 3A的Masson染色结果所示，成年lncRNA-ZFAS1转基因小鼠(transgenic mice，TG)心脏组织中胶原沉积比野生型小鼠(wild type mice，WT)明显增加。此外，TG组心脏组织中α-SMA的表达显著高于WT组(Fig 3B，P<0.01)。并且与WT组相比，TG组Ⅰ型胶原(Col1a1)和Col3a1的表达显著升高(Fig 3C，P<0.05)。这表明lncRNA-ZFAS1过表达转基因小鼠出现了心肌纤维化。

3 讨论

lncRNA-ZFAS1作为长链非编码RNA家族中的一员，在细胞核和细胞质中均有表达，并且其在人和小鼠中具有约70%的保守性[7]。lncRNA-ZFAS1对多种肿瘤的发生、发展具有调控作用。Xie等[11]研究证实，lncRNA-ZFAS1通过靶向miR-484促进结直肠癌细胞增殖和侵袭。有研究表明，lncRNA-ZFAS1在胃癌组织中高表达，这种高表达是诱发胃癌细胞增殖和迁移的重要原因[12]。在胶质瘤中，lncRNA-ZFAS1可以通过激活内皮间质转化(EMT)和Notch信号通路促进胶质瘤发展，降低晚期胶质瘤患者生存率[13]。此外，Li等[14]研究发现，lncRNA-ZFAS1通过靶向抑制miR-150，从而调控ZEB1、MMP14和MMP16的表达，进而抑制肝癌转移。随着研究深入，我们课题组发现lncRNA-ZFAS1不但对肿瘤具有调控作用，对心血管系统也发挥重要作用。我们研究发现lncRNA-ZFAS1具有成为心肌梗死外周血诊断标志物的潜力，对心肌细胞中SERCA2a蛋白具有抑制作用，从而诱发心肌细胞内钙超载，引起心肌梗死后心脏功能障碍和心肌细胞凋亡[6-8]。lncRNA-ZFAS1在心肌细胞中的作用已经相对明确，但是其对心肌成纤维细胞以及心肌纤维化的调控作用尚不明确。

本研究中，我们首先构建在体心肌纤维化模型，利用Masson染色确定心肌纤维化模型构建成功，进一步检测发现心肌纤维化组织中lncRNA-ZFAS1的表达显著升高。提示lncRNA-ZFAS1对心肌纤维化具有潜在调控作用。离体水平进一步研究发现敲减lncRNA-ZFAS1后，由Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞中纤维化相关因子TGFβ1和Ⅲ型胶原表达显著降低，这表明敲减lncRNA-ZFAS1对心肌纤维化具有保护作用。有趣的是，在心肌细胞特异性过表达lncRNA-ZFAS1的转基因小鼠的心脏组织中出现胶原沉积，并且纤维化相关蛋白α-SMA和Ⅰ型胶原以及Ⅲ型胶原的表达显著升高。前期研究已经阐明lncRNA-ZFAS1在心肌细胞中的高表达会引发心肌细胞凋亡。有研究显示，心肌细胞凋亡与心肌纤维化密切相关，心肌细胞凋亡会刺激心肌成纤维细胞增殖从而导致心肌纤维化[15]。这可能是lncRNA-ZFAS1转基因小鼠心脏组织产生纤维化的原因。但是具体机制仍有待进一步研究。

Fig 3 The myocardial fibrosis in lncRNA-ZFAS1 transgenic mice

综上，本研究发现lncRNA-ZFAS1对心肌纤维化具有调控作用，敲减lncRNA-ZFAS1具有抗心肌纤维化的效果。