非标记依赖的石墨烯核酸适配体传感器用于赭曲霉毒素A的均相快速检测

伍银环，刘弘锌，吕远平，邓锐杰

(四川大学轻工科学与工程学院，四川 成都 610065)

赭曲霉毒素(Ochratoxin)是曲霉菌属和青霉菌属的某些菌种通过一系列代谢活动所产生，是目前引起世界广泛关注的霉菌毒素之一[1].它包含7种结构相似的化合物，它的基本结构为苯甲酸异香豆素[2].这7中结构中属赭曲霉毒素A(OTA)的毒性最大、范围最广、产毒量最高、对农产品存在严重污染，广泛存在于谷物以及饲料当中，与人类的健康密切相关[3-4].OTA对大多数哺乳动物具有肝毒性、肾毒性、神经毒性、致畸性和致突变性[5].更糟糕的是，OTA可能会污染许多食物和饮料，如谷类食品、坚果、咖啡、啤酒和葡萄酒[6-7].OTA还具有极强的化学稳定性，在温度高于250℃时才会发生分解[8].欧盟规定在成人食用的谷物中OTA的含量不能超过3μg·kg-1，用于婴幼儿食用以及特殊医疗目的食品的谷物中OTA含量不能超过0.5μg·kg-1[9].我国食品安全标准规定谷物原料中OTA含量不能超过5μg·kg-1，饲料中OTA不得高于100μg·kg-1[10].因此，发展快速、灵敏的OTA检测方法对于保障食品安全和人类健康具有重要意义.高效液相色谱(HPLC)以及其质谱联用技术是目前OTA检测的标准方法，具有准确度和可靠性高等特点，但是由于依赖大型仪器，无法应用于现场检测.近年来，发展的酶联免疫方法以及包括表面等离子体共振(SPR)和电化学免疫等新型传感方法有望用于OTA污染的现场检测.然后这些方法大部分依赖分离过程，且利用抗体的检测方法受限于抗体的稳定性，价格也比较昂贵.因此，建立一种操作简便，耗时短成本低的检测手段对OTA的检测是至关重要的(表1).

表1 OTA检测方法对比Table 1 Comparison of OTA detection methods

石墨烯是一种二维纳米材料，具有独特的碳六元环晶体结构[11].氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的一种衍生物，其表面有很多具有较强亲水活性的含氧官能团，比如羟基和羧基，这些基团使氧化石墨烯能够均匀地分散在水相中，具有良好的水溶性[12-13].GO以其优异的电子、机械、表面功能、水分散性和增强荧光猝灭能力[14]等性能在生物领域受到越来越多的关注同时，GO表面具有大量的π-π分子结构，能够使核酸链很好的吸附在GO的表面，故而可以作为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)的受体[15-18].此外，GO还可以结合单链DNA(ssDNA)在碱基和GO之间通过疏水、氢键和小分子叠置相互作用发生[19-20].然而，它几乎不能与刚性双链DNA(dsDNA)或良好折叠的DNA相互作用DNA[21].石墨烯与DNA的特异性相互作用可以用于构建光学、电学和比色传感器.

核酸适配体又称为适配体、适配子等，一般是由几个或几十个核苷酸组成的单链DNA或者RNA序列，可以通过经典的指数富集配体系统进化(SELEX)过程从DNA或RNA池中选择[22-23].核酸适配体能与靶标分子实现高亲和力和高特异性的结合.与抗体相比，核酸适配体具有筛选程序简单、稳定性高、成本低、活性均一、合成简便和修饰方便等优点[24-26].此外，相对抗体使用过程中需要固定与洗涤等复杂处理方法，核酸适配体可应用于均相检测技术和耦合多种信号放大技术，不仅检测方法简单、快速，而且可实现更灵敏的检测.目前基于适配体技术的均相检测方法有比色法、荧光法等[27-28].

本研究结合靶标触发核酸适配体构型响应及嵌入型核酸染料Eva Green，构建了一种用于OTA均相快速检测的石墨烯核酸适配体传感器.核酸适配体与OTA结合可改变其与石墨烯相互作用，Eva Green具有良好的稳定性，在正常的储存和操作中不会被破坏，它的引入可以非共价标记监测核酸适配体与石墨烯的结合状态，进而定量检测OTA.在没有OTA的情况下，由于OTA核酸适配体的发卡型结构，导致其不易吸附在GO表面[29]，故体系的荧光值较高.在体系中加入OTA后，由于OTA的存在触发OTA核酸适配体的构型变化，发卡结构被打开从而被GO吸附，导致体系的荧光值降低.改方法只需在室温条件下一个离心管内混合反应即可，反应结束后可直接检测荧光信号，其检测动态范围是1～10 ng·mL-1，检出限为0.17 ng·mL-1.该方法能高特异性区分OTA与食品中的赭曲霉毒素B(OTB)及其他毒素，如:玉米赤戊烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素B1(AFB1)等.该方法成功应用于啤酒OTA污染的检测分析.

1 材料与方法

1.1 实验试剂与设备

OTA核酸适配体序列为GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATC(参照文献[1]设计)，合成于擎科生物；赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)玉米赤戊烯酮毒素(ZEN)、黄曲霉毒素B1(AFBI)标准品购于普瑞邦生物工程有限公司(分析纯)；氧化石墨烯购于先丰纳米公司；Eva Green购于安诺伦(北京)生物科技有限公司公司.

荧光光谱以及荧光强度由多功能微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)测得；黑色384微孔板(Greiner Bio-One公司)；PCR管(生工生物工程(上海)股份有限公司)；200μL吸头(生工生物工程(上海)股份有限公司)；10μL吸头(生工生物工程(上海)股份有限公司)；移液枪.样品放置在384微孔板中，在波长480 nm处被激发，所有的发射光谱在室温下从510到650 nm的波长范围内收集.所有实验都在室温下进行且至少重复三次.

1.2 实验条件优化

优化的反应条件包括OTA核酸适配体、氧化石墨烯、OTA的浓度及反应时间.其中OTA核酸适配体浓度取0.1～10μM，GO浓度取1～100μg·mL-1，OTA浓度为0.1～100 ng·mL-1，反应时间为0～40 min.

1.3 荧光检测OTA

(1)用分子级水将各试剂稀释到一定的浓度，将4μL OTA溶液、4μL OTA核酸适配体溶液以及适量体积的水(使得反应结束时溶液终浓度为初浓度的0.1倍)加入离心管中混匀反应15 min；

(2)再向混合液中加入4μL石墨烯溶液，反应20～30 min；

(3)最后向离心管中加入4μL Eva Green后，立即将混合溶液注入到384孔板中，用多功能微孔板检测仪对其进行荧光检测，记录在480 nm处的荧光值，根据实验所得标准曲线方程式计算出OTA的浓度.

1.4 实时荧光测定

研究了时间对荧光强度变化的影响.将所有的试剂加入384微孔板中，最后加入Eva Green然后立即放入多功能微孔板检测仪中实时测定荧光强度，检测时间为0～40 min.

1.5 选择性测试

为了验证实验所用核酸适配体的特异性，我们选择了OTB、ZEN以及AFB1与之进行比较.首先在离心管中加入1.5μM的OTA核酸适配体、10 ng·mL-1的OTA、OTB、ZEN、AFB1，再加入适量的水，反应15 min；然后向混合液中加入25μg·mL-1的GO溶液，反应20～30 min；最后加入10×的EvaGreen后将溶液加入到384微孔板中立即用多功能微孔板检测仪测定480 nm处的荧光值.

1.6 样品测定

(1)样品处理:取啤酒试样，使用前先置于4℃冰箱冷藏30 min(低温有利于减少样品中的气泡)后对其进行超声脱气，在室温条件下离心10 min，使样品中的杂质沉淀，转速为800 rpm，离心后过滤除去沉淀，将啤酒溶液稀释100倍，向稀释后的啤酒溶液中加入不同浓度的OTA(1ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1).

(2)实际样品荧光测定:将4μL含有OTA的啤酒溶液、4μL核酸适配体溶液以及适量体积的水(使得反应结束时溶液终浓度为初浓度的0.1倍)加入离心管中混匀反应15 min；再向混合液中加入4μL GO溶液，反应20～30 min；最后向离心管中加入4μL 20×Eva Green后，立即将混合溶液注入到384孔板中，用多功能微孔板检测仪对其进行荧光检测，记录在480 nm处的荧光值，根据实验所得标准曲线方程式计算出OTA的浓度.

2 结果与讨论

2.1 实验原理

基于GO和核酸适配体构建的生物传感器检测原理如图1所示.通过加入嵌入式核酸染料EvaGreen，可以实现非共价标记核酸适配体，点亮核酸适配体探针.由于核酸适配体的发夹结构使其不容易被氧化石墨烯吸附，从而荧光不会被猝灭；当目标检测物(OTA)存在的情况下，OTA核酸适配体在与靶结合时从发卡结构转变为OTA/OTA核酸适配体复合物，通过π-π共轭以及范德华力[11]，使适配体和OTA形成的复合物可吸附在氧化石墨烯的表面，由于FRET的作用，氧化石墨烯猝灭了核酸适配体和OTA/Evagreen的复合物携带的荧光信号，从而可由荧光值的差别来对OTA进行检测，且检测体系中的OTA浓度越高，荧光信号降低程度越大.

图1 石墨烯核酸适配体传感器用于赭曲霉毒素A的均相快速检测原理图Fig.1 Working principle for graphene aptasensor for rapid homogeneous detection of ochratoxin A

2.2 适配体浓度优化

适配体的浓度为0.1～10μM，实验结果显示(图2(A))，随着核酸适配体浓度的增长，荧光强度越强，当适配体浓度为1.5μM时，背景与信号的比值(噪信比)最大，故而后续实验适配体的浓度采用1.5μM.

图2 原理验证及核酸适配体优化(A)在OTA适配体(黑色)、OTA适配体/GO(蓝色)和OTA适配体/GO/OTA(红色)存在下体系的荧光发射光谱)；(B)不同OTA适配体浓度下体系的荧光强度Fig.2 Principle verification and optimization of nucleic acid aptamer(A)Fluorescence emission spectra of the system in the presence of OTA aptamer(black)，OTA aptamer/GO(blue)and OTA aptamer/GO/OTA(red)；(B)Fluorescence intensity of the system at different OTA aptamer concentration

2.3 石墨烯浓度优化

在荧光检测平台中引入GO可以得到较低的背景，而高浓度GO则可能导致荧光回收率较低.因此对GO的浓度也需要进行优化.图3(A)显示了不同浓度GO存在时OTA/OTA核酸适配体的荧光信号变化.由图可知，随着GO的浓度增加，荧光强度不断减弱，当GO浓度为10μg·mL-1时背景与信号的比值(噪信比)最大，比值为3.59.

2.4 实时荧光测定

研究了GO/适配体探针对靶标分子的实时响应(图3(B)).如图3(B)所示，荧光强度在0～20 min的时间范围内显著减少，在20 min之后信号趋于稳定.因此，选择20 min的时间检测OTA.

图3 氧化石墨烯及时间的优化(A)不同OTA适配体浓度下体系的荧光强度；(B)不同反应时间下体系的荧光强度Fig.3 Optimization of graphene oxide and time(A)Fluorescence intensity of the system at different OTA aptamer concentrations；(B)Fluorescence intensity of the system under different reaction time

2.5 标准曲线以及检出限

方法的灵敏度是决定其适用性的关键参数.为了评估OTA测定的灵敏度，研究了GO/适配体探针对不同浓度的OTA的响应，荧光信号如图4(A)所示，荧光值随着OTA浓度的增加而逐渐降低，OTA在0-10 ng·mL-1范围内呈良好的线性关系(图4(A)).检测限为0.17 ng·mL-1，该LOD符合欧盟委员会食品法规对用于直接人食用的加工谷类产品中OTA的检测要求[40].这些结果表明，该石墨烯核酸适配体传感器有望作为一种OTA的快速现场检测方法.

2.6 选择性

为了研究该试验方法的选择性，选择了与OTA结构类似的OTB及其他真菌毒素(ZEN和AFB1)进行验证，结果如图4(B)所示，在相同条件下，OTA引起的荧光信号变化明显大于OTB、ZEN以及AFB1引起的信号变化.可见，由于核酸适配体对OTA的固有特异性，只有OTA才能诱导出显著的信号.OTB、ZEN以及AFB1只引起微弱的荧光信号变化.因此，该对OTA的检测具有良好的选择性，表明其在复杂样品分析中的应用具有潜在的可能性.

图4 标准曲线及选择性(A)不同浓度OTA条件下体系的荧光强度，浓度分别为:0，0.1，1.5，2.5，3，5，10，25，50，75，100ng·ml-1；(B)体系中OTA的选择性Fig.4 Standard curve and selectivity(A)Fluorescence intensity of the system in the response to OTA at various concentrations:0，0.1，1.5，2.5，3，5，10，25，50，75，100 ng·mL-1；(B)Selectivity of the designed sensing system for OTA

2.7 样品分析

为了进一步验证所设计的测定方法在检测食物样本中的可行性，我们对啤酒样品进行了OTA的加标回收实验，用本实验方法测定三种不同浓度OTA(1，5，10 ng·mL-1)的回收率(表2)，回收率在91.6～113%之间，验证了该方法可应用在具有复杂基质的食品样品中OTA的定量检测.

表2 啤酒中OTA加标回收检测结果Table 2 Detection of OTA in beer

3 结论

综上所述，我们利用靶标分子触发的核酸适配体构型变化及嵌入型核酸染料，构建了石墨烯适配体传感器实现了对OTA的均相快速、非标记依赖的检测.该方法涉及OTA触发核酸适配体构型变化、GO的荧光淬灭能力以及核酸染料非共价标记效应.核酸适配体的结构响应性及其与GO的相互作用调控可实现对OTA快速灵敏的响应.与其他基于核酸适配体的OTA检测方法相比，该方法不需要进行共价标记和带修饰的核酸适配体，降低了成本和复杂性.该方法将OTA核酸适配体、GO与OTA样品在室温下简单混合即可检测OTA，并具有优异的灵敏度(0.17 ng·mL-1)和选择性.此外，该方法能够准确检测出啤酒中OTA的含量，并且通过选择与其他毒素相对应的核酸适配体利用该方法可检测其他毒素，如:黄曲霉毒素B1、卡那霉素等.因此有望为食品安全领域真菌毒素的检测控制提供新的工具，在食品安全领域具有潜在的应用价值.