外周血T-SPOT.TB和38kD-IgG检测在活动期结核病诊断中的应用

王永锋，徐焰

西安大兴医院检验科，陕西 西安 710016

结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，感染结核分枝杆菌后机体通常会产生一系列细胞免疫和体液免疫变化，累及全身各个器官组织[1-2]。因此，对于结核病应尽早诊断并积极采取有效措施进行治疗。然而，结核病早期临床症状并不明显，误诊情况时有发生。目前结核病的临床诊断仍主要依靠细菌学检测，然而其检测过程复杂，检测时间较长，且涂片敏感性较差，难以区分活菌、死菌和非结核分枝杆菌，不利于肺外结核的早期诊断[3]。抗结核抗体(38kD-IgG)和结核感染T 细胞斑点试验(T-SPOT.TB)是近年来引入临床检测结核病的有效方法[4]，目前已广泛应用于临床。本研究通过对比38kD-IgG、T-SPOT.TB 试验在诊断活动期结核病上的诊断价值，旨在为活动期结核病的临床诊断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年8月至2019年11月西安大兴医院收治的141 例结核病患者进行研究，141 例结核病患者最终确诊活动期结核病患者97 例(活动期结核病组)，非活动期结核病患者44 例(非活动期结核病组)，另选择同期在我院体检的60 例健康志愿者作为对照组。纳入标准：(1)活动期结核病组、非活动期结核病组患者均符合中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布的《肺结核诊断标准(WS288-2017)》[5]中关于活动性结核病和非活动性结核病的相关诊断标准；(2)对照组健康体检者经胸部X线片、生化检测、免疫学检查证实身体健康，无结核病史和近期结核患者密切接触史者。排除标准：(1)合并有心脑血管疾病，造血系统疾病以及肝、肾等重要脏器有严重器质性病变者；(2)有免疫抑制剂用药史、放化疗治疗史者。活动期结核病组中男性61 例，女性36例；年龄27～74岁，平均(47.38±6.19)岁；活动期肺结核61 例，活动期结核性胸膜36 例。非活动期结核病组中男性 28 例，女性 16 例；年龄 25～71 岁，平均(47.45±6.21)岁。对照组中男性37例，女性23例；年龄24～73岁，平均(47.41±6.33)岁。三组受检者的性别、年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者家属知情并同意签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 外周血T-SPOT.TB 检测及阳性判定 本研究的T-SPOT.TB 试剂盒购自上海复星高科技有限公司，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行：入院后，采集各组受检者的5 mL 外周静脉血置于真空肝素钠抗凝管中，采用Ficoll 淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs)。在抗INF-γ抗体预包被的细胞计数板中加入AIM-V无血清培养液、B抗原滤液培养蛋白10(CFP10)、A 抗原早期分泌性靶抗原6(ESAT6)各50 μL，同时加入50 μL 细胞培养基作为空白对照，放置在37℃5%二氧化碳的培养箱中培养16～20 h。取出培养板中舍弃孔内液体，清洗干净后在孔内加入50 μL新鲜酶标抗体溶液，于2℃～8℃下培养1 h，之后再加入50 μL 底物溶液，在室温条件下显色反应7 min，经蒸馏水清洗后进行干燥处理，采用ELISPOT自动计数仪进行斑点计数。

依据斑点计数确定检测结果：阴性对照斑点数≤5 个，ESAT6 或 CFP10 斑点数-阴性对照斑点数＞7 个时，检测结果为阴性；阴性对照斑点数＞5个，ESAT6或CFP10 斑点数-阴性对照斑点数≥阴性对照组斑点数的两倍时，检测结果为阳性。

1.2.2 38kD-IgG检测及阳性判定 各组受试者在入院后采用真空肝素钠抗凝管采集外周静脉血5 mL，迅速混匀后在最短时间内采用玻璃棒剥离纤维蛋白，以确保血液标本无浑浊沉淀，以防止吸入堵塞反应膜孔。采用斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)原理检测血清标本中的38kD-IgG，试剂盒购自潍坊市康华生物技术有限公司，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。该试剂中的结核分枝杆菌能够捕获血清中的含结核IgG抗体，与葡萄球菌A蛋白(SPA)结合形成特异性红色斑点，若检测结果出现红色斑点，则判定为阳性，否则为阴性。

1.3 统计学方法 应用SPSS21.0 统计学软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组受检者的T-SPOT.TB、38kD-IgG试验阳性率比较 活动期结核病组患者的T-SPOT.TB 阳性率和38kD-IgG阳性率分别为90.72%、74.23%，明显高于非活动期结核病组的77.27%、54.55%和对照组的8.33%、6.67%，非活动期结核病组的T-SPOT.TB 阳性率和38kD-IgG阳性率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 三组受检者的T-SPOT.TB、38kD-IgG试验阳性率比较[例(%)]

2.2 T-SPOT.TB、38kD-IgG试验对活动期结核病的诊断效能比较 T-SPOT.TB试验在诊断活动期结核病上的敏感度、特异度、准确度以及阳性预测值和阴性预测值明显高于38kD-IgG试验，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.3 活动期结核病组和非活动期结核病组患者的T-SPOT.TB 斑点计数比较 两组患者的ESAT6 斑点计数比较差异无统计学意义(P＞0.05)；活动期结核病组患者的CFP10、ESAT6 合并CFP10 斑点计数明显高于非活动期结核病组患者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表2 T-SPOT.TB、38kD-IgG试验诊断活动期结核病的效能比较(%)

表3 活动期结核病组和非活动期结核病组患者的T-SPOT.TB斑点计数比较

表3 活动期结核病组和非活动期结核病组患者的T-SPOT.TB斑点计数比较

例数88 34组别活动期结核病组非活动期结核病组t值P值ESAT6 24.33±6.29 22.92±6.71 1.090 0.278 CFP10 60.46±13.84 41.27±9.38 7.442 0.001 ESAT6合并CFP10 86.24±20.92 68.31±18.33 4.387 0.001

3 讨论

结核分枝杆菌感染及严重程度与结核分枝杆菌的毒性、数量以及自身免疫等因素有关[6]。一般情况下，机体感染结核分枝杆菌后处于潜伏状态，体内的结核分枝杆菌处于静止状态；机体免疫功能下降时，体内的结核分歧杆菌由静止状态转变为活跃状态，此时潜伏感染则转变为活动期结核病[7-8]。早期诊断和治疗对于减少和控制结核病的发展和传播具有重要意义。

T-SPOT.TB 试验、38kD-IgG 试验作为近年来兴起的结核病检查手段，在临床上应用广泛[9]。本研究结果显示，活动期结核病患者的T-SPOT.TB 阳性率和38kD-IgG 阳性率分别为90.72%、74.23%，均明显高于非活动期结核病患者健康体检者(分别为77.27%、54.55%和8.33%、6.67%)，非活动期结核病组的T-SPOT.TB 阳性率和38kD-IgG 阳性率均明显高于健康体检者。结果说明T-SPOT.TB试验、38kD-IgG试验在临床诊断具有一定应用价值。

38kD-IgG 试验通过检测纯化结核分枝杆菌胞壁蛋白38kD抗原检测血液中相应的IgG抗体，进而能够对体内是否存在结核分枝杆菌进行判断[10]。由于38kD-IgG抗体是一种免疫显性分泌蛋白，在其他分枝杆菌中也广泛存在，交叉反应较高；另外，38kD-IgG抗体通常出现在结核病中晚期，早期检测可能会出现假阴性[11]。因此在一定程度上限制了38kD-IgG 试验在诊断活动期结核病中的应用。

结核感染T 细胞斑点试验(T-SPOT.TB)以γ-干扰素释放试验为基础，通过检测单细胞上的结核分枝杆菌判断疾病[12]，其使用的ESAT6、CFP10二种特异性抗原主要集中在结核分枝杆菌复合群中，与绝大多数非结核分枝杆菌及卡介苗都没有交叉反应[13-14]，因此具有较高的敏感性和特异性，且不受机体免疫状态影响。本研究结果显示，T-SPOT.TB 试验在诊断活动期结核病上的敏感度、特异度、准确度以及阳性预测值和阴性预测值分别为90.72%、77.27%、86.52%、89.90%和79.07%，均明显高于38kD-IgG 试验的74.23%、54.55%、68.09%、78.26%和48.98%，与相关文献报道相符。另外，在T-SPOT.TB 试验中，每个斑点代表一个致敏的T 淋巴细胞，斑点数目的增加能够在一定程度上代表结核病的活动程度[15-16]。本研究结果显示，活动期结核病组患者的CFP10、ESAT6 合并CFP10 斑点计数均明显高于非活动期结核病组患者。因此，通过观察患者的斑点计数，能够在一定程度上体现结核病患者的活动程度。

综上所述，T-SPOT.TB 试验在诊断活动期结核病上较38kD-IgG 试验更加敏感、准确，对于排除非活动期结核病、减少不必要的抗结核治疗具有重要意义。另外，结核病的活动性随着T-SPOT.TB试验斑点计数的增加而增加，因此T-SPOT.TB试验在评估活动期结核病严重程度上也能够发挥一定作用。