广州地区2460例呼吸道感染患者7种呼吸道病原体RNA检测结果分析

刘胜男，侯铁英，廖建枫，史艳萍，郑有为，吴 际，黄 革*

[1.广东省人民医院(广东省医学科学院) 检验科，广东 广州510080；2.南部战区总医院第四派驻门诊部 检验科，广东 广州510010]

急性呼吸道感染(ARTI)是最常见的感染性疾病之一，发病率居急性传染病的首位。95%的急性上呼吸道疾病和大部分的下呼吸道疾病是由细菌外的病原引起的，例如病毒、支原体或衣原体等，且容易出现复合感染。核酸双扩增法作为新研发的病原体核酸检测分子生物学技术，可以一次性检测流感病毒(FluA/FluB)、副流感病毒(PIV- 1/2/3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AdV-B/E)、肺炎支原体(MP)以及肺炎衣原体(Cpn)7种较为常见的引起急性呼吸道感染的细菌外病原体。此外，已有研究证实咽候拭子是目前监测呼吸道病原体的首选标本之一[1]。本文采用核酸恒温双扩增法检测2460例呼吸道感染患者咽喉拭子中7种呼吸道病原体RNA并对其结果进行分析，旨在探讨呼吸道病原体现症感染的分布情况，以及在不同性别、年龄组、季节的感染特点，为临床防治提供准确、有效的病原学依据及流行病学参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年3月至2020年2月广东省人民医院门诊及住院呼吸道感染患者2460例。排除重复病例。其中，女性874例，男性1586例；少年组(<18岁)687例；青年组(18-44岁)318例；中年组(45-59岁)346例；老年组(>59岁)1109例，年龄划分参照世界卫生组织 (WHO) 2016 年年龄分类标准[2]。

1.2 仪器与试剂

试剂为武汉中帜生物科技股份有限公司研制的7项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(双扩增法)。仪器为Tethys85全自动化学发光酶免仪和MiniG-R100干式恒温器。

1.3 检测方法

使用咽喉植绒拭子采集患者咽部上皮细胞并置于细胞保存液中，当日及时检测，未能及时检测标本置-20℃保存。采用核酸恒温双扩增法定性检测患者咽部脱落细胞中7种呼吸道病原体RNA，包括流感病毒(FluA/ FluB)、副流感病毒(PIV- 1/2/3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AdV-B/E)、肺炎支原体(MP)以及肺炎衣原体(Cpn)。每个样本均同时检测18SrRNA以保证咽喉拭子取材成功，每批次试验均设立阳性和阴性对照。根据试剂盒说明书判读结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS23.0软件进行统计学分析，计数资料组间比较采用χ2检验或者Yates连续性校正χ2检验，当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 7种呼吸道病原体mRNA阳性检出率

2460例呼吸道感染患者中，呼吸道7项病原体RNA阳性208例，阳性检出率为8.46%(208/2460)。其中单一感染200例，占比96.15%(200/208)，混合感染8例，占比3.85%(8/208)。单一感染为主要的感染模式。混合感染主要的感染模式为呼吸道合胞病毒合并副流感病毒，有4例，检出率为0.16%，在混合感染中占比50%。在7种呼吸道病原体中，阳性率最高的是呼吸道合胞病毒，70例阳性，阳性率为2.85%，占总阳性的33.65%，其次为肺炎支原体和副流感病毒。各病原体RNA阳性检出率见表1。

表1 2460例咽喉拭子标本呼吸道病原体RNA阳性检出率

2.2 7种呼吸道病原体RNA在不同性别、年龄和季节的阳性检出情况

2.2.1不同性别呼吸道病原体RNA阳性检出情况 女性肺炎支原体RNA的阳性检出率(3.20%)显著高于男性(1.89%)，差异有统计学意义(P<0.05)，其余6种病原体的阳性检出率无性别差异(P>0.05)，见表2。

表2 不同性别组呼吸道病原体RNA阳性检出率

2.2.2不同年龄组呼吸道病原体RNA阳性检出情况 不同年龄组呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒的阳性检出率比较差异有统计学意义(P<0.05)。少年组呼吸道合胞病毒的阳性率(3.93%)、副流感病毒的阳性率(3.35%)、腺病毒的阳性率(1.31%)高于其他年龄组，见表3。

表3 不同年龄组呼吸道病原体RNA阳性检出率

2.2.3不同季节呼吸道病原体RNA阳性检出情况 甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肺炎支原体RNA阳性检出率在不同季节中比较差异具有统计学意义(P<0.05)，春季的阳性检出率最高；甲型流感病毒和呼吸道合胞病毒在秋季的阳性检出率最低；副流感病毒和肺炎支原体在冬季的阳性检出率最低，见表4。

表4 不同季节呼吸道病原体RNA阳性检出率

3 讨论

呼吸道感染是临床最常见的疾病之一，由于引起急性呼吸道感染的病原体种类繁多、传播快、感染力强，且同一种病原体可引起多种临床症状，不同的病原体亦可引起相似的临床症状[3-4]，因此要求实验室能够对呼吸道病原体快速检测和早期鉴别以协助临床对呼吸道感染进行早期防控和治疗[5]。作为引起急性呼吸道感染最主要的病原体，病毒、支原体或衣原体难以培养，而免疫学检测则有抗原检测灵敏度低，抗体检测窗口期的缺点，因此，分子生物学检测技术成为其首选手段。恒温双扩增技术作为新型分子检测手段，通过T7线性扩增和多生物素信号放大系统检测病原体在宿主细胞内转录的mRNA，反映的是病原体在宿主体内的复制活性，有效甄别患者呼吸道感染是否为现症感染，从而为临床提供更准确的诊断信息。

由于不同地区和不同年份的病原体流行性不尽相同[6-7]，所以定期或不定期对本地区呼吸道感染的病原学和流行病学调查研究对呼吸道感染的有效预防尤为重要[8]。本文通过对2019年3月至2020年2月呼吸道感染患者mRNA检测结果分析来提供该时间段呼吸道疾病现症感染的流行病学特征。

本研究对广州地区2640例呼吸道感染患者7种呼吸道病原体mRNA检测结果分析，阳性率为8.46%，低于之前研究报道的呼吸道病原体IgM抗体检出率[4,8-9]，也明显低于已有报道的通过荧光定量PCR检测的呼吸道病原体核酸的检出率[10]。我们分析可能存在几方面的原因。一方面，由于不同地区，不同年份的季节气候特点以及人群易感性不同，呼吸道病原检测阳性率在不同地区或者不同年份可能存在一定差异。广州属于海洋性亚热带季风气候，温暖多雨，夏季长，冬季阴冷时间短，呼吸道病原体流行时间较北方地区短。另一方面，我们检测的是病原体在宿主细胞内转录的mRNA，只有现症感染患者才可能检测阳性，而有研究指出呼吸道病原体的特异性IgM抗体可在感染后的2-3个月持续存在[11]。MP感染后1个月时其DNA的检出率仍然高达50%，MP-DNA持续携带的中位数时间为7周，个别长达7个月之久[12]；此外，2020年1月至2月期间，由于COVID-19疫情的爆发和居家隔离防疫策略的实施，也有效阻断了其它呼吸道病毒的传播和流行，使本该高发呼吸道疾病的冬季各病原体的阳性检出率显著下降，进而导致统计期间这七种呼吸道病原体总阳性检出率的下降。就单一病原体而言，甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒的阳性检出率高于之前抗体IgM检测的报道，肺炎衣原体与腺病毒阳性率与报道相一致，而肺炎支原体、乙型流感病毒、副流感病毒阳性检出率则低于之前的研究[8]。

此外，本研究也从性别、年龄、季节等几个方面分析了广州地区急性呼吸道传染病的流行特点。研究发现女性患者肺炎支原体阳性率显著高于男性患者(P<0.05)，但由于本研究中男女构成比有较大差异且目前针对性别对呼吸道传染病影响的研究尚少，因此结论还需进一步证实。年龄方面，研究结果显示少年组呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒的阳性率显著高于其他年龄组，与王丽等人的研究一致[8]。其可能原因一是由于少年人群频繁出入学校、公共交通等人群密集的公共场所，有更多的机会接触呼吸道病原体引起交叉感染，另一是少年人群免疫系统发育尚未完全，对呼吸道病原体的抵抗力较成年人差，是呼吸道病原体感染的高危人群，导致呼吸道病原体更容易在少年人群中传播。季节方面，研究结果显示呼吸道病原体的流行与季节有密切关系。甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肺炎支原体的阳性检出率在四个季节中存在显著性差异(P<0.05)，春季的阳性检出率最高，这与谢红梅等人的研究相一致[9]，提示春季为广州地区呼吸道传染病的高峰季节，广州地区应在春季加强呼吸道传染病的防护工作。值得注意的是，由于广州地区冬季较暖，而且因COVID-19疫情居家隔离相关政策的影响，本研究结果显示广州地区呼吸道病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体的流行情况并未像北方地区那样在冬季表现得尤为严峻，还需更多数据进一步论证。

综上所述，呼吸道病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体现症感染的主要模式为单一感染，少数病例表现为混合感染；其中，呼吸道合胞病毒和肺炎支原体的阳性率最高，在全年均有检出；少年组的阳性检出率最高，春季是阳性检出率最高的季节。本研究通过对广州地区2460例呼吸道感染患者7种呼吸道病原体RNA检测结果分析为广州地区呼吸道感染的病原学和流行病学研究提供了相关数据。