一株固态发酵甘蔗渣产类胡萝卜素脉孢菌的分离鉴定

骆 琴， 邓清月， 唐 森， 张 鹏

（广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西来宾 546119）

脉孢菌属（Neurospora）真菌是一类腐生菌，有较强的抗逆性，广泛分布于各种生态环境中，该属真菌易培养且菌体无毒（Gmoser等，2018）。脉孢菌繁殖能力较强，对营养要求简单，可单独或联合其他菌种发酵多种农副产品生产类胡萝卜素及复合酶制剂，通过发酵也可将农副产品转化为高营养的功能性饲料。

王倩男等（2017）利用好食脉孢菌（N.sitophila）发酵醋糟生产类胡萝卜素，色素含量117.68 μg/g，使废弃的醋糟成为功能性饲料。经脉孢菌高温发酵后，豆粕中胰蛋白酶抑制因子减少，粗蛋白质及酸溶蛋白含量升高，提高了其饲用价值（郑婷婷等，2015）。王晓杰等（2008）用好食脉孢菌固态发酵玉米酒糟，其蛋白质组分升高，同时溶解性提高，使其成为一种新型饲料。孙铁男等（2019）用好食脉孢菌固态发酵麦麸生产类胡罗卜素，经工艺优化后产量为147.38 μg/g，有效提高了麸皮的利用率。 吴邦国（2018）用粗糙脉孢菌（N.crassa）固态发酵预处理过的玉米秸秆，能有效提高其营养价值，改善其适口性，克服玉米秸秆难消化、营养价值低的问题。贾金如（2017）用粗糙脉孢菌联合（Candida utilis和 Phanerochaete chrysosporium）固态发酵稻草，降解了其木质纤维素，同时提高了蛋白质的含量，改善了蛋白类饲料的品质。

本试验从发霉变质的甘蔗渣中分离纯化出一株色素产生菌，编号为NC2636。通过观察其培养特征和显微特征，以及采用构建基于ITS序列系统发育树的方法确定菌株NC2636的分类地位。并以菌株NC2636的分生孢子悬液为菌种固态发酵甘蔗渣，采用分光光度法对从发酵物中提取的色素进行定性定量分析。本研究旨在为菌株NC2636在甘蔗渣功能性饲料化上的进一步开发和应用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 甘蔗渣：由广西来宾湘桂糖业有限责任公司提供；马铃薯：市售；无水葡萄糖、技术琼脂粉、丙酮、乙酸乙酯、无水乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备 中草药粉碎机 （FW-135），天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（GZX-GF101-3-S），上海沪粤明科学仪器有限公司；恒温培养箱（DHP-9162），太仓市科教器材厂；恒温摇床（TH2-C），太仓市实验设备厂；电子分析天平（FA-2004B），上海越平科学仪器有限公司；电热恒温水槽（DK-8D），上海一恒科学仪器有限公司；立式压力灭菌锅（TYAIB 024/10），宁波久兴医疗器械有限公司；洁净工作台（SW-CJ-1D），江苏苏洁净化设备厂；紫外-可见分光光度计（UV-2600），岛津企业管理（中国）有限公司；超声波清洗机（KQ-300DE），昆山市超声仪器有限公司；台式高速离心机（TD5A-WS），湖南湘仪实验仪器开发有限公司；冷冻离心机（HC-2518R），安徽中科中佳科学仪器有限公司；PCR仪（2720 thermal cycler），美国应用生物系统公司；电泳槽（DYCP-31DN），北京六一仪器厂；稳压电泳仪（DYY-5），北京六一仪器厂；凝胶成像仪（FR980），上海复日科技仪器有限公司。

1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g，无水葡萄糖20 g，技术琼脂粉18 g，水 1 L，pH 自然，121℃高压灭菌 20 min。

1.4 菌株分离 采用组织分离的方法，在无菌操作条件下，用接种针挑取霉变的甘蔗渣表面黄色颗粒物质划线于PDA平板培养基，在28℃恒温培养箱内培养24 h，反复挑取边缘菌丝划线于新的PDA平板，获得一株真菌纯培养物，编号为NC2636，转入PDA斜面培养基4℃保存。

1.5 菌株鉴定

1.5.1 形态特征鉴定 形态学分类鉴定以 《真菌鉴定手册》为依据（魏景超，1797）。将纯培养菌株NC2636接种于PDA平板，目测观察菌落的形态是否符合脉孢菌属的基本形态特征。采用水浸片法制片，挑取不同生长阶段的菌丝用乳酸石碳酸棉兰染液染色，于双目显微镜下观察菌丝显微特征并照相。

1.5.2 分子生物学鉴定

1.5.2.1 ITS序列测定 使用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，产品编号：SK8259]提取菌株NC2636的基因组DNA。基因扩增以NC2636的基因组DNA为模版，ITS序列扩增引物为真菌内转录间隔区1和 2 通用引物：ITS1 （5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增片段序列长度为600 bp左右。

PCR 反应体系（25 μL）：模板（菌株 NC2636基因组 DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）1 μL，Taq Plus DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，引物 ITS1、ITS4（10 μmol/L）各 0.5 μL，加双蒸 H2O 至 25 μL。 PCR 循环条件：预变性（94 ℃，4 min）、变性（94 ℃，45 s）、退火（55 ℃，45 s）、延伸（72 ℃，1 min），共 30 个循环；修复延伸（72 ℃，10 min）；终止反应（4 ℃，4 h）。PCR产物经1%琼脂糖电泳分离检测。DNA目的条带经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒[生工生物工程 （上海）股份有限公司，产品编号：SK8131]纯化回收后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5.2.2 序列分析 将菌株NC2636的ITS序列提交至NCBI的Genebank数据库获得登录号。将所得序列进行BLAST比对，与Genebank数据库中的序列进行同源性分析。从Genebank数据库下载同属以及相近科属物种的ITS序列，使用MAFFT 7.0软件进行多序列比对分析，以Apodus deciduus的ITS序列为外类群，使用MEGA 7.0软件采用NJ（Neighbor-joining）法构建系统发育树。

1.6 菌株NC2636的固态发酵 用接种环挑取28℃光照条件下培养18 h的PDA平板培养基上的菌丝转接于PDA斜面培养基上，28℃光照条件下培养数日直至PDA斜面表面产生橙色的分生孢子。用无菌生理盐水冲洗斜面表面的孢子，倒入装有玻璃珠的广口锥形瓶中，摇床振荡3 h，计数后配制成浓度为1.5×107个/mL孢子悬液作为接种液。将甘蔗渣置于45℃鼓风干燥箱内烘干，粉碎，过20目标准筛备用。取5 g处理好的甘蔗渣置于250 mL广口锥形瓶中，按液料比4：1加入45℃无菌水20 mL，封口，浸泡4 h后121℃高压湿热灭菌30 min。在无菌操作条件下，向冷却的甘蔗渣培养基内接入1 mL孢子悬液，混匀，置于恒温培养箱内，28℃光照条件下静置培养6 d。

1.7 类胡萝卜素的提取与测定 参照孙轶男等（2019）方法，略作改动。取烘干后的发酵产物1.0 g置于研钵中加入1.0 g石英砂，充分研磨后，加入 10 mL 丙酮-乙酸乙酯混合溶液（2：3，V：V），置于超声波清洗机中超声处理15 min（300 W，25℃）后，室温下避光浸提2 h后取出，离心机5500 r/min，离心10 min，收集上清液，即得类胡萝卜素浸提液。用紫外-可见分光光度计在波长400～700 nm内扫描类胡萝卜素浸提液，确定最大吸收波长，适当稀释提取液后测定最大吸收波长处的吸光度，按以下公式计算类胡萝卜素含量（邓永平等，2018；李静等，2017）：

式中：Aλmax为色素最大吸收波长处的吸光度；N为测定试样的稀释倍数；V为提取色素有机溶剂体积，mL；M为发酵产物质量，g；0.16为类胡萝卜素的摩尔消光系数。

2 结果与分析

2.1 筛选菌株的鉴定

2.1.1 培养和形态特征 菌株在PDA平板上，迅速生长，匍匐菌丝白色，疏松，有树状分支，没有典型菌落形成；培养24 h之后肉眼可见菌丝体组织呈絮状，可见气生菌丝，均匀生长，呈白色绒毛状；培养48 h之后，菌丝体粗壮而致密，淡黄色，与培养基结合较牢固，菌丝体组织表面干燥，上层出现成堆黄色粉末状颗粒，有一股霉味。

菌株NC2636菌丝经乳酸石碳酸棉兰染色后，菌丝组织成蓝色。菌丝组织稀疏，呈丝状，有分枝，为有隔菌丝；气生菌丝顶端可观察到分生孢子链；分生孢子为球形、卵圆形至椭圆形。

综上所述，根据菌株NC2636的培养特征和显微特征，查《真菌鉴定手册》可知，该株真菌与脉孢菌属（Neurospora）真菌的形态特征描述较为符合 （魏景超，1797），故通过形态特征鉴定菌株NC2636应为一株脉孢菌（Neurospora sp.）。

2.1.2 菌株NC2636的ITS序列分析 为了进一步明确菌株NC2636的分类地位，提取菌株NC2636基因组DNA，以真菌内转录间隔区1和2通用引物进行ITS序列PCR扩增。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离检测，凝胶成像结果见图1。扩增得到基因片段凝胶电泳条带单一、明亮，与Marker条带比较发现，目的基因片段大小为500～600 bp，将目的条带用试剂盒回收后测序。测序结果表明，菌株NC2636的ITS序列大小为554 bp，两者相符。

图1 菌株NC2636的ITS序列PCR扩增产物电泳图

将菌株NC2636的ITS序列测序结果输入Genbank进行BLAST比对，与Genebank数据库中的序列进行同源性分析。结果显示NC2636的ITS序列与脉孢菌属（Neurospora）的多种真菌具有很高的同源性。选取脉孢菌属内与菌株NC2636同源性较高的8株真菌，以及与脉孢菌属科属亲缘关系较近的2株真菌，以Apodus deciduus的ITS序列为外类群构建系统发育树。如图2所示，菌株NC2636与Neurospora crassa（KR399979）在同一分支上，同源性达到了100%，结合其培养特征和显微特征，故将菌株NC2636鉴定为一株粗糙脉孢菌（Neurospora crassa），菌株NC2636的ITS序列从Genebank数据库获得的登录号为MT821452。

图2 基于ITS序列采用邻接法构建的菌株NC2636系统发育树（括号内为序列登录号）

2.2 菌株NC2636的色素特征及含量测定 在可见光区400～700 nm波长范围内扫描检测提取的色素样品，由图3可知，最大吸收峰的波长为469 nm，在其两侧444 nm和501 nm处有两个明显的肩峰，符合类胡萝卜素的“三手指型”特征性吸收曲线（肖亦农等，2013；罗金亮等，2013），依据现有文献报道类胡萝卜素化合物最大吸收波长及双肩峰吸收波长特征可知，番茄红素可能为菌株NC2636所产的类胡萝卜素的主要成分（王海滨，2004）。在最大吸收波长469 nm下，测定吸光度，由类胡萝卜素含量计算公式可以得出，发酵物类胡萝卜素含量为95.63 μg/g。

图3 色素的可见光区扫描图谱

3 讨论

采用酵母、细菌、放线菌等微生物发酵甘蔗渣，可以使蔗渣中的纤维素、半纤维素和木质素降解成能被动物体直接利用的糖类物质，同时在发酵过程中由微生物自身代谢生产的蛋白质、氨基酸、还原糖等营养物质，能提高甘蔗渣的适口性及营养价值，使其成为一种优质饲料 （胡咏梅等，2006）。粗糙脉孢菌（N.crassa）具有完整的木质纤维素降解酶系，可作为天然的木质纤维素快速降解菌（林良才等，2014），已被用于发酵稻草、玉米秸秆等农副产品，使它们成为营养价值较高的功能性饲料（吴邦国，2018；贾金如，2017）。本研究从霉变的甘蔗渣中分离得到一株粗糙脉孢菌，通过实验证明该菌株能在单一营养源甘蔗渣上生长并产生类胡萝卜素色素，其主要成分可能为番茄红素，但产量较低，因此以甘蔗渣为主要营养源通过发酵生产类胡罗素卜素为目的固态发酵工艺有待于进一步优化（阙发秀等，2019；李静等，2017；李陈陈等，2017）。综上所述，粗糙脉孢菌有潜力作为候选菌种通过微生物发酵方法来解决甘蔗渣饲料化的难题。

4 结论

本研究通过观察分离于霉变甘蔗渣中的产色素菌株NC2636的培养特征和显微特征，并结合分子生物学方法将其鉴定为一株粗糙脉孢菌（N.crassa）。通过分光光度法确定菌株NC2636固态发酵甘蔗渣所产的色素为类胡萝卜素，最大吸收波长为469 nm，推测色素主要成分可能为番茄红素，28℃固态发酵6 d，色素含量为95.63 μg/g。因此，利用菌株NC2636固态发酵甘蔗渣既可能实现甘蔗渣的功能性饲料化，也能获得天然的类胡萝卜素，同时为甘蔗渣的资源化利用提供一种思路。