发酵食品微生物检验方法及其质量控制研究

【摘   要】   传统发酵食品检验方法因受到死菌细胞和杂质颗粒的影响，导致检验稳定性不高。因为，利用消除法处理活菌图像中的黑色连通区域，去除杂质颗粒，通过检测空心去除死菌细胞。根据处理后的活菌图像提取活菌特征参数，将提取到的参数输入到BP神经网络，得到发酵产物微生物检验结果。在此基础上，利用模糊控制技术设计反馈控制，通过温度参数的反馈实现对发酵食品微生物的质量控制。结果表明，研究的发酵食品微生物检验方法灵敏度高，精密度满足检验需求，且稳定性得到了提升。

【关键词】   发酵食品;微生物检验;质量控制;食品安全;模糊控制

Research on Microbiological Inspection Methods and Quality

Control of Fermented Food

Chi Yufen

（Fuzhou Liming Vocational and Technical College，Fuzhou 350109，China）

【Abstract】Due to the influence of dead cells and impurity particles， the traditional inspection methods of fermented food are not stable. The black connected area in the live bacteria image is processed by the elimination method to remove the impurity particles. The dead bacteria cells are removed by detecting the hollow. The characteristic parameters of the live bacteria are extracted according to the processed live bacteria image. The extracted parameters are input into the BP neural network to obtain the microbiological test results of the fermentation products. On this basis， fuzzy control technology is used to design feedback control， through the feedback of temperature parameters to achieve the quality control of fermented food microorganisms. The results showed that the microbial detection method of fermented food had high sensitivity， precision and stability.

【Key words】fermented food; microbiological examination; quality control; food safety; fuzzy control

〔中圖分类号〕 TS207.4   〔文献标识码〕  A             〔文章编号〕 1674 - 3229（2021）03- 0000 - 00

0     引言

发酵食品主要通过微生物作用制取获得，该类食品发展到现在适应范围已经非常广泛，是目前食品工业中重要分支[1]。随着发酵食品的发展，在给食品工业添加色彩的同时，也带来了一些安全问题[2]。由于发酵工艺本身使用的微生物来源比较广泛，在培养过程中容易受到污染，菌群形成也比较复杂，很难控制，发酵过程中容易混有有害菌株，导致在发酵食品中存在一些有害的代谢产物;另外，在发酵过程中如果对杂菌含量控制不当，也会出现培养基或反应过程中含有有害菌，影响发酵食品质量[3-5]。对于这种情况，发酵食品的微生物在线检验受到越来越多的重视。

现阶段，国内外已经有了一些自动的微生物分析技术问世，如基于高通量测序的检验方法和基于扩增子测序的检验方法，但以上两种方法受到死菌细胞和杂质颗粒的影响，对于活菌的检验存在灵敏度低，精密度不高的情况[6-8]。因此，提出一种新的发酵食品微生物检验方法，同时研究其质量控制，解决传统检验方法中存在问题，为发酵食品的安全发展提供理论基础。

1     发酵食品微生物检验方法设计

1.1   提取活菌图像特征参数

在提取活菌图像特征参数之前，采用中速定量滤纸去掉绝大部分的杂质颗粒，但是处理完成后在活菌图像中还是存在一部分杂质颗粒[9]。因此，在提取活菌图像中的特征参数之前，需要采取一定的手段将非菌体的部分剔除掉。考虑到绝大多数的活菌体内部存在空心这一特点，采用大区域消除法去除掉黑色连通区域面积过大的杂质颗粒，将连通区域中的所有像素值置为白色，消除该区域。并且在消除完成后，通过扫描空心去除死菌影响[10]。

扫描去除黑色连通区域的活菌图像，假设剩余连通区域的[X]轴和[Y]轴坐标的最大值分别为[Xmax]、[Ymax]，最小值为[Xmin]、[Ymin]，利用公式计算出中心点坐标，计算公式如下：

[Ox=Xmax-Xmin2Oy=Ymax-Ymin2] （1）

通过计算的中心坐标，结合周围八个方向点的像素值之和，判断出该连通区域是否为空心。如果以上9个点之和不为零，说明该连通区域是空心的，反之，则是实心区域。当判断出连通区域为实心区域，则将该区域所有像素值置为白色，消除该区域，去除死菌影响。消除结果如图1所示。

为了更准确地提取出活菌图像中的特征参数，对二值图像扫描，找到第一像素值为0的点，以该点为起始点进行顺时针轮廓跟踪，直到回到起始点，此时跟踪结束[11]。将跟踪后形成的区域填充为灰色，完成单个菌体细胞的空洞填充，待扫描完成后，将所有灰色区域填充为黑色。

利用公式计算出利用链码进行跟踪时的菌体面积，计算公式如下：

[S0=i=1nκixyi-1+12κiy] （2）

公式中[n]表示链码总数，[i]表示8个方向，[y]表示纵坐标，[κiy]表示纵坐标上对应点的坐标，如图2所示。

完成填充后，提取活菌图像中的特征参数。根据微生物细菌的形态学特征，提取的参数特征包括菌体区域面积、菌体边界长度、形状因子和偏心率[12]。其中菌体区域面积计算公式如公式（2）所示。菌体边界长度是链码所围细菌细胞区域的周长，上述中链路为8连通区域，在此情况下，默认垂直和水平的步幅为1，则其对角幅为[2]，则周长[L]计算公式为：

[L=nr+nu2] （3）

公式中，[n]表示链码的偶数码的数目，[u]表示链码中的奇数码的数目。在所有特征参数中，形状因子主要用来描述菌体细胞区域与圆形偏离、以及菌体表面褶皱的程度[13]。该特征参数计算公式如下：

[G=L24πS0] （4）

当活菌体呈现标准形状时，计算出的[G]值为1，当菌体形状与标准形状偏离得越严重，形状因子[G]偏离1越远。计算特征参数中的偏心率，需要先计算出长轴长和短轴长[14]。计算公式如下：

[Pw=maxv=1iκvx+x0-minv=1iκvx+x0Ph=maxv=1iκvy+y0-minv=1iκvy+y0] （5）

公式中，[κv]表示活菌图像上的任意一点，[κvx]表示横坐标上的分量，[κvy]表示纵坐标上的分量，[x0]与[y0]表示起始点的坐标。则长轴长和短轴长分别为：

[fc=maxPw，Phfi=minPw，Ph] （6）

偏心率计算公式为：

[η=fcfi] （7）

公式中，[fc]表示区域长轴，[fi]表示区域短轴，在实际计算中偏心率的值会略大于实际值，这是因为活菌图像数字化会产生边角效应[15]。通过以上过程区分出菌体细胞和杂质颗粒，从中提取出能够描述细菌的形状特征作为微生物检验参数，以便用于后续的微生物检验。

1.2   检验分类器设计

以提取出的特征参数作为输入，利用BP神经网络，实现发酵食品微生物检验。设计BP神经网络时，以提取的特征参数作为输入层的神经元，输出层包含一个神经元，设置细菌的导师信号是0.9，非细菌的导师信号为0.1。隐含层中的神经元数通过计算获得：

[n1=β+ω+α] （8）

公式中，[β]表示输出神经元数，[ω]表示输入神经元数，[α]表示常数，[α∈1，10]。使用双曲正切[S]型函数将神经元的输入范围为[-∞，+∞]映射到[-1，1]，当各个神经元采用[S]型函数时，使用两个隐含层即可实现任意输入的任意函数，检验出发酵食品中各类微生物。[S]型函数表示为：

[Sx=11+e-x] （9）

将提取的特征参数输入到设计的BP网络中后，采用[S]型函数，使用任意两个隐含层即可实现发酵食品微生物的检验。

2     发酵食品微生物质量控制设计

发酵食品微生物质量与发酵温度息息相关，微生物发酵过程中主要分为菌体生长和产物生产两个阶段，只有在最优温度的环境条件下，使微生物质量符合最优温度条件，才能得到最佳产物。

在发酵食品微生物质量控制中，采用模糊控制，以温度作为反馈参数，通过温度的反馈控制质量的变化。温度的控制则通过调节冷却水流量来实现。模糊控制结构如图3所示。

在发酵食品微生物质量控制过程中，首先设定一个温差阈值[T']，通过比较实际温差绝对值与温差阈值实现控制。当[T>T']时，采用模糊控制加快响应速度，调节环境温度;当[T=T']时，采用控制器实现反馈，控制微生物质量。

3     发酵食品微生物检验方法及质量控制实验研究

3.1   实验材料及设备

发酵食品种类比较多，在实验研究中选择一种比较典型的蔬菜发酵制品酸菜作为研究目标，酸菜主要以大白菜为原料，利用天然的微生物进行乳酸发酵，在发酵过程中，微生物群落不断变化，情况比较复杂。因此，使用酸菜作为实验目标，对不同检验方法的对比分析具有重要意义。使用不同的微生物检验方法在相同的实验条件下分析其灵敏度以及精密度。实验中使用的试剂如表1所示。

实验中使用的设备有生物传感器、电热手提式压力蒸汽消毒器、电子天平、生化培养箱、pH计、离心机、熒光定量PCR仪以及分光光度计。

3.2   细菌培养及材料制备

准备液体培养基和固体培养基，使用酵母、NaCl和胰蛋白胨溶于去离子水中，待粉末完全溶解后，使用NaOH溶液调整pH值到7.4，制成液体培养基，待灭菌操作后，放入无菌操作台待用。固体培养基是在液体培养基的基础上，加入琼脂粉，高压灭菌后备用。

在实验之前，取出一定量的液体培养基，在无菌操作台上接入大肠杆菌菌种，将其放入摇床中，设置好转速与温度，经过一定时间的处理，得到饱和的菌悬液;选取一定量的酸菜发酵液，通过过滤去除掉液体中的杂质，得到无杂质的滤液，经过高压灭菌后，将菌悬液注入到灭菌酸菜液中，混合摇匀后，得到实验样品，根据实验需求将其分组，其中一组用于验证，另外三组用于检验。

3.3   灵敏度实验及分析

采用荧光定量分析方法进行检验，根据检验结果的吸收峰图谱，分析不同检验方法的灵敏度。实验结果如下所示。

对比观察图中结果可知，图a中显示五种菌株反应基本相同，没有检验出发酵乳酸产物，其灵敏度差;相比之下，图b中菌株05的检出限得到了提高，但是依然没有检验出发酵乳酸产物，其灵敏度较高;图c中显示五种菌株中只有菌株05出现阳性吸收峰，菌株05对发酵乳酸才有产物生产，其灵敏度更高。这说明所提发酵食品微生物检验方法在检验过程中没有受到死菌细胞和杂质颗粒的影响，在实验样品中准确地检验出了发酵乳酸产物。

3.4   精密度实验及分析

精密度实验主要根据不同检验方法对实验样品中不同菌种的检出率，计算出回归方程，根据标准的回归方程和相关参数分析不同检验方法的精密度。精密度实验结果如表2所示。

从表中结果可以看出，传统的检验方法中不同菌种的峰面积跨度比较大，RSD值也比较高，说明两种检验方法精密度不够;而设计的检验方法不同菌种之间峰面积相差不大，并且RSD值比较低，说明该方法的精密度比较高。结合灵敏度实验结果可知，所提发酵食品微生物检验方法的灵敏度高，精密度能够满足检验需求，说明所提方法优于传统的发酵食品微生物检验方法。

4     结语

食品微生物发酵是一个比较复杂的过程，具有较高的不确定性，研究发酵食品卫生检验方法及其质量控制可以在很大程度上保证食品安全。本文针对传统的检验方法中的问题，设计具有针对性的处理方法，以达到解决相关问题的目的。通过对比实验证明了提出的方法的稳定可靠。但是研究过程中发现了一些问题，提出的检验方法自动化程序不够高效，需要消耗一定的人力资源成本，在后续的研究中可从这一方面进行深入研究。

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[收稿日期]   2021-02-12

[基金项目]   2019年福建省中青年教师教育科研项目“基于高职药物制剂技术专业的就业情况调查与人才培养的研究”（JAS19743）

[作者简介]   池玉芬（1985- ），女，硕士， 福州黎明职业技术学院讲师，研究方向：食品营养与检测。