UHPLC-MS/MS法测定氟苯尼考明胶纳米药物在小鼠体内的血药浓度

亓馨怡，侯冰玉，李建科，姚霄月，黄晶晶，李臣贵

UHPLC-MS/MS法测定氟苯尼考明胶纳米药物在小鼠体内的血药浓度

亓馨怡，侯冰玉，李建科，姚霄月，黄晶晶，李臣贵*

（山东农业大学动物科技学院/动物医学院山东 泰安 271018）

为了建立一种测定氟苯尼考明胶纳米药物在小鼠体内血药浓度的超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS/MS）方法。采用内标法对比法，以甲砜霉素为内标，利用乙酸乙酯提取血浆中的药物，优化色谱质谱条件，建立了测定氟苯尼考明胶纳米在小鼠血液中浓度的方法。结果表明，方法特异性良好，氟苯尼考在6.17~789.6 ng·mL-1内线性关系良好，提取回收率、准确度、精密度和稳定性均符合要求。本试验建立了一个专属性强，灵敏度高，重现性好的UHPLC-MS/MS方法，能够准确的测定氟苯尼考明胶纳米药物在小鼠体内的血药浓度。

高效液相色谱-质谱联用；氟苯尼考明胶纳米药物；体内药物分析；小鼠

氟苯尼考为美国先灵葆雅公司1988年研制，我国1999年批准在中国上市的一种兽用氯霉素类抗生素，广泛应用于敏感菌所致的畜禽及鱼类疾病的防治[1-2]，作为一种动物专用广谱抗生素，在动物细菌性传染疾病的防治中具有巨大的应用前景[3]。但氟苯尼考在水溶液中几乎不溶解[4-6]，大大限制了在兽医临床中的应用。前期笔者制备了新型氟苯尼考明胶纳米药物，提高了氟苯尼考溶解性，增加了其在体外的缓释性能。但尚未建立体内分析方法，无法研究其在体内的释放行为。本实验旨在建立测定小鼠体内氟苯尼考明胶纳米药物血药浓度的方法，为研究氟苯尼考纳米药物在小鼠体内的代谢动力学提供方法和支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 高效液相色谱-质谱联用仪（双高压泵、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化接口、三重四极杆质谱检测器）、色谱工作站、高速离心机（1612–1型，上海医疗器械集团有限公司）、便携式样品浓缩仪（PRO-12L Plus，南京利昭仪器设备有限公司）、超纯水机（威立雅水处理技术(上海)有限公司）、涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.1.2 药品 氟苯尼考（药用对照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、甲砜霉素（99.5 %，MACKLIN）、乙腈（色谱纯，SIGMA-ALORICH）、乙酸乙酯（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司）、甲醇（色谱纯，SIGMA-ALORICH）、氟苯尼考明胶纳米药物（实验室自制）。

1.1.3 供试动物 昆明小鼠（济南朋悦实验动物繁育中心）。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱与质谱条件 （1）色谱条件：色谱柱 AccucoreTM C18柱（2.1×100 mm，2.6 μm)；流动相甲醇-水（50:50）；流速0.2 ml/min；柱温30 ℃；进样量3 μl。（2）质谱条件：离子化方式HESI；离子检测方式SRM；扫描方式：负离子扫描；电喷雾电压2700V；鞘气40 Arb；辅助气1 Arb；离子传输管温度300 ℃；热喷雾温度275 ℃。检测离子对：氟苯尼考（356.152/335.9），甲砜霉素（354.129/ 184.9）。

1.2.2 试剂配制 （1）氟苯尼考储备液：精密称取氟苯尼考对照品9.87 mg，置于25 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得394.8 μg/ml氟苯尼考的储备液。（2）甲砜霉素（内标）储备液：精密称取甲砜霉素对照品10.85 mg，置于25 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得434.0 μg/ml甲砜霉素的储备液。（3）氟苯尼考标准添加溶液：取储备液0.05 ml置于10 ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得1.974 μg/ml氟苯尼考甲醇溶液。（4）甲砜霉素标准添加液：取储备液0.05 ml置于10 ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得2.17 μg/ml甲砜霉素甲醇溶液，依次稀释，配成217 ng/ml的甲砜霉素甲醇对照品溶液。（5）氟苯尼考线性溶液：取氟苯尼考标准添加液，依次稀释，配成789.6、394.8、197.4、98.7、49.35、24.68、12.34、6.17 ng/ml的氟苯尼考甲醇对照品溶液。

1.2.3 血浆样品预处理 精密量取血浆20 μl至2 ml具塞离心管，加入100 μl甲砜霉素内标涡旋3 min，加入乙酸乙酯500 μl，涡旋5 min，6 000 r/min离心5 min，吸取上清液至另一离心管，下层浊液加入500 μl乙酸乙酯涡旋5 min重提一次，合并提取液，氮气吹干。加入500 μl甲醇涡旋3 min复溶，加入500 μl水，涡旋3 min，0.22 μm滤膜过滤后取3 μl进样检测。

2 结果与分析

2.1 色谱特异性

分别取氟苯尼考和甲砜霉素溶液加入小鼠血浆中，按“血浆样品预处理”项处理后进样，记录色谱质谱图，结果显示在本试验条件下，氟苯尼在3.60 min左右出峰，内标甲砜霉素保留时间在3.14 min左右，空白血浆无杂峰干扰测定，氟苯尼考与甲砜霉素分离良好。可见本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中氟苯尼考与甲砜霉素的浓度。

2.2 回收率

2.3 线性及线性范围

取离心管数支，分别精密加入不同量的氟苯尼考标准液，吹干后加入空白血浆20 ml，旋涡30 s混匀，配成氟苯尼考浓度分别为789.6、394.8、197.4、98.7、49.35、24.68、12.34、6.17 ng/mL标准含药血浆，按“血浆样品预处理”项操作，记录色谱图，计算待测物的峰面积As与内标峰面积Ai的比值ƒ，以比值ƒ（ƒ=As/Ai）对待测物浓度C作回归计算。计算待测物的峰面积As与内标峰面积Ai的比值ƒ，以比值ƒ（ƒ=As/Ai）对待测物浓度C作回归计算，得回归方程ƒ=0.0197×C+0.0052，r2= 0.9994，权重系数w=1/C2。结果显示氟苯尼考血药浓度在6.17-789.6 ng/ml范围内，ƒ与C线性关系良好。

2.4 精密度和准确度

（1）取2 ml塑料离心管数支，精密加入不同量的各对照品溶液，以氮气流吹干，加入50 μl空白小鼠血浆，旋涡30 s混匀，配成氟苯尼考浓度分别为6.17、98.7、789.6 ng·mL–1的标准含药血浆，按照“血浆样品预处理”操作。共做三批，每批随行一条标准曲线，每批每个浓度做5份样品。记录色谱图，计算待测物的峰面积As与内标峰面积Ai的比值ƒ，分别将f代入当天的标准曲线求得实测浓度，计算批内和批间精密度。由表1所示，批内和批间精密度均符合要求。（2）取精密度测得浓度与加入浓度比较，计算相对准确度及RSD，结果如表2所示，测定平均相对准确度为98.9 %，RSD=1.9 %，符合要求。

表1 小鼠血浆中氟苯尼考的批内和批间精密度

表2 小鼠血浆中氟苯尼考的准确度测定结果

2.5 小鼠血浆样品中氟苯尼考的稳定性

（1）取离心管数支，精密加入不同量的氟苯尼考对照品溶液，吹干后加入50 μl空白血浆，旋涡30 s混匀，配成浓度分别为6.17、98.7、789.6 ng·mL–1的标准含药血浆，每个浓度各做若干份样品。（2）1份于配制好后按“血浆样品预处理”项操作后，于不同时间进行LC–MS/MS分析，记录色谱图和峰面积，计算待测物的峰面积As与内标峰面积Ai的比值ƒ，考察样品溶液的稳定性。（3）冻融稳定性检测：3份于配制好后按“血浆样品预处理”项操作后立即提取分析，记录色谱图和峰面积，计算待测物的峰面积As与内标峰面积Ai的比值ƒ，代入标准曲线求得实测浓度计算实测浓度平均值，此为立即测定样品；3份于配制好后放入冰箱于 –20 ℃ 冰冻后取出化冻，反复冻融3次后按“血浆样品预处理”项操作提取分析，记录色谱图和峰面积，计算待测物的峰面积As与内标峰面积Ai的比值ƒ，代入标准曲线求得实测浓度计算实测浓度平均值，与立即测定样品的对应实测浓度相比，考察冻融稳定性。由表3可知，3个浓度在4 h内，待测物的峰面积As与内标峰面积Ai的比值ƒ的RSD均小于10 %，表明4 h内样品溶液稳定性良好。由表4可知，氟苯尼考3个浓度在反复冻融3次后与立即测定样品的实测浓度的比值在97 % ~101 % 之间，表明反复冻融3次后样品稳定性良好。

表3 样品溶液稳定性 (ƒ=As/Ai)

表4 冻融稳定性 (ni=3)

3 结论

本试验建立了测定小鼠血浆中氟苯尼考的LC–MS/MS法，测定条件下小鼠血浆中内源性物质不干扰待测物及内标的测定，提取回收率均大于85 %。氟苯尼考标准曲线线性范围6.17~ 789.6 ng/ml，线性关系良好；高、中、低三种浓度的批内、批间精密度RSD均小于10 %，准确度为95.6 %～101.1 %；氟苯尼考血浆样品在室温下放置4 h、反复冻融3次条件下稳定性良好。实验结果表明，所建立方法样品处理时间短，方法重现性、专属性好，可用于氟苯尼考在小鼠体内的血药浓度分析。

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国家自然科学基金（31602111）；中国博士后基金（2017M612314）；山东省重大科技创新工程（2019JZZY010735）；山东省“双一流学科”和大学生创新创业训练计划项目（201910434022）

*通讯作者

（2020–10–19）

S851.34

A

1007-1733（2021）01-0007-04