NOX4在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

宁显会 卢涵宇 蒋怀礼 翟长文 王胜资 王德辉

(1.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科 上海 200031；2.复旦大学附属中山医院耳鼻喉科 上海 200032；3.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院病理科 上海 200031；4.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院放疗科 上海 200031)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是起源于鼻咽部黏膜上皮的恶性肿瘤。放射治疗(简称放疗)是鼻咽癌的主要治疗方法。特别是调强放疗的应用，明显改善了患者的预后。但是由于肿瘤细胞的异质性，肿瘤细胞表现出不同程度的放疗敏感度，即存在放疗抵抗[1]。由于放疗抵抗引起的肿瘤残留、局部复发和远处转移成为鼻咽癌患者治疗失败的主要原因[1]。因此找寻有价值的生物标志物来预测鼻咽癌的放疗敏感度，提高鼻咽癌患者的生存预后至关重要。NOX4是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)家族成员之一。NOX4在多种人类肿瘤中表达，与肿瘤发生，癌细胞增殖、转移、侵袭，DNA损伤，抗凋亡，上皮间充质转化(EMT)，化疗耐药等密切相关[2]。此外，NOX4还可能抑制肿瘤对放疗的敏感度，造成肿瘤对放疗的抵抗[3]。然而NOX4在鼻咽癌中的作用尚不清楚。本文通过检测鼻咽癌组织和正常鼻咽部黏膜组织中NOX4的表达，分析NOX4与鼻咽癌患者临床病理学特征、放疗敏感度和生存预后的关系，旨在探讨NOX4在鼻咽癌中的表达和临床意义。

1 资料与方法

1.1 病例收集 收集2012年1～6月在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院确诊的鼻咽癌患者97例，其中男性74例、女性23例；中位年龄54岁(范围8～80岁)。所有患者均经过病理活检证实为鼻咽癌，均为初发鼻咽癌，肿瘤无远处转移，确诊前未经过任何抗肿瘤治疗。收集病理证实为正常鼻咽部黏膜组织20例。另外，收集2010～2018年确诊的同一患者的初发和复发鼻咽癌组织22对。所有鼻咽癌组织标本均来源于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院病理科存档蜡块。病例收集和蜡块用途经复旦大学附属眼耳鼻喉科医院伦理委员会批准，相关操作按伦理委员会章程进行。

1.2 免疫组织化学染色 以磷酸盐缓冲液代替一抗为空白对照，正常肾脏组织切片为阳性对照。NOX4蛋白着色于细胞核。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占百分比：阴性为0分，阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度×阳性细胞所占百分比≥3分为免疫反应阳性。乘积范围：0～12分，判定0～2分(-)，3～5分 (+)，6～ 8分 (++)，9～ 12分 (+++)，(+++)判定为NOX4高表达[4-6]。免疫组织化学染色结果的判定由2名病理科主治医师完成，2名病理科主治医生对患者的临床信息不知晓。

1.3 评价标准

1.3.1 鼻咽癌TNM分期标准 采用美国癌症联合委员会(AJCC)2010年鼻咽癌TNM分期标准[7]。

1.3.2 鼻咽癌放疗敏感与抵抗 放疗敏感定义为根治性放疗后3个月原发病灶和淋巴结无残留，2年内无原发灶和颈部淋巴结复发；放疗抵抗定义为根治性放疗后3个月原发病灶和(或)淋巴结有残留，2年内有原发灶和(或)颈部淋巴结复发[8]。

1.4 统计学处理 用统计软件SPSS 23.0进行统计学分析。分类资料组间比较用Mann-WhitneyU检验。单因素及多因素分析采用logistic二元和多元回归。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，以Log-Rank法进行组间比较，生存多因素采用Cox回归分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理资料分析 所有患者均接受调强放射治疗，总放疗剂量为65.3～70.8 Gy，中位放疗剂量为67.5 Gy。97例患者中，12例(12.4%)为单纯放疗，85例(87.6%)合并化疗，12例(12.4%)合并靶向治疗。化疗方案：诱导化疗±同步化疗或辅助化疗。诱导或辅助化疗方案：TPF[多西他赛70 mg·m-2·d-1(D1)+ 顺铂 20 ～ 25 mg·m-2·d-1(D1 ～ 3)+5-氟尿嘧啶 500 mg·m-2/·d-1(D1 ～ 4)]或 PF 方案 [顺铂 20 ～25 mg·m-2·d-1(D1 ～ 3)+5-氟尿嘧啶500 mg·m-2·d-1(D1～ 4)]。同步化疗方案 [顺铂 20～ 25 mg·m-2·d-1(D1～3)]。靶向治疗方案：泰欣生200 mg/周，6～8次。自患者放疗结束开始随访，截至2018年12月31日，中位随访时间78个月(7～81个月)。至放疗结束后3个月，32例(33%)患者存在肿瘤残留，其中18例(56.3%)为原发灶残留，14例(43.8%)为淋巴结残留。至随访时间结束，复发11例(11.3%)，9例为原发灶复发，2例为颈部淋巴结复发，放疗结束至复发中位时间24个月(12～59个月)。发生远处转移20例(20.6%)，放疗结束至发生远处转移的中位时间为17个月(2～55个月)。死亡28例(28.9%)，放疗结束至死亡的中位时间为29个月(7～81个月)。

2.2 NOX4与鼻咽癌患者临床病理特征的相关性免疫组织化学结果显示NOX4主要定位于细胞核。NOX4的表达情况见图1。NOX4在鼻咽癌组织中的表达高于正常鼻咽部黏膜组织(P=0.008)。NOX4与鼻咽癌患者临床病理特征的相关性见表1，结果显示临床分期(P=0.003)和复发(P=0.007)与NOX4的表达相关，而性别、年龄、吸烟史、病理类型、远处转移与NOX4表达无关(P＞0.05)。

图1 鼻咽癌和正常鼻咽部黏膜组织中NOX4的表达(免疫组织化学染色 ×200) A.鼻咽癌组织中NOX4高表达；B.鼻咽癌组织中NOX4低表达；C.正常鼻咽部黏膜组织中NOX4低表达。

表1 NOX4与鼻咽癌患者临床病理特征、放疗敏感度的相关性

2.3 NOX4与鼻咽癌患者放疗敏感度的相关性 根据肿瘤对放疗的敏感度，将97例鼻咽癌患者分为放疗敏感组60例和放疗抵抗组37例。结果显示放疗抵抗组NOX4表达高于放疗敏感组(P＜0.001；表1)。logistic 回归单因素和多因素分析显示NOX4与放疗敏感度有关(P＜0.001)，表明NOX4是鼻咽癌放疗敏感度的独立预测因素。

2.4 NOX4与鼻咽癌患者生存预后的关系 Kaplan-Meier法绘制生存曲线，结果显示NOX4低表达的鼻咽癌患者生存明显好于NOX4高表达的 患 者 (P＜0.001； 图2)。Cox 回归分析显示NOX4(P=0.023)、年龄 (P=0.012)、复发 (P=0.001)、远处转移(P＜0.001)与生存有关，而性别(P=0.673)、吸烟(P=0.617)、病理类型(P=0.138)、放疗次数(P=0.269)、化疗(P=0.603)、靶向治疗(P=0.08)、临床分期(P=0.439)与生存无关。表明NOX4是鼻咽癌患者生存预后的独立预测因素。

图2 NOX4与鼻咽癌患者生存时间的关系

2.5 同一患者初发和复发鼻咽癌组织中NOX4的表达 检测同一患者初发和复发鼻咽癌组织中NOX4的表达情况。结果显示复发鼻咽癌组织中NOX4表达高于初发鼻咽癌组织(P=0.002)。

3 讨论

放疗是鼻咽癌的主要治疗方法。虽然放疗技术的进步明显改善了患者的预后，但仍然有10%～30%的鼻咽癌患者在放疗后出现肿瘤残留和复发[9]，是鼻咽癌治疗失败的主要原因。由于残留和复发，患者5年生存率仅为12.4%～27%[10]。根治性放疗后局部残留率为7%～13%[11]，局部复发率为8.4%～23%[12]。本研究中，97例鼻咽癌患者根治性放疗后3个月残留率为33%(32例)，高于文献报道，可能与肿瘤分期较晚(32例患者中 、期占94%)有关。至随访时间结束，局部复发率为11.3%，9例为原发灶复发，2例为颈部淋巴结复发，复发中位时间为24个月。另外，本研究发现根治性放疗后远处转移率为20.6%，发生远处转移的中位时间为17个月，与文献报道的远处转移率20%[13]基本一致。鼻咽癌放疗后肿瘤残留、复发的主要原因与肿瘤缺乏放疗敏感度有关。因此，找寻一种能够预测鼻咽癌放疗敏感度的生物标志物至关重要。

NOX4是NADPH氧化酶(NOX)家族成员，在多种人类肿瘤中表达，如胶质母细胞瘤、肾癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、甲状腺癌等[14]。有研究[15]表明，NOX4在结肠癌组织中高表达，并与患者的临床分期、不良预后高度相关。 NOX4过表达是口腔鳞状细胞癌患者接受手术切除后预后较差的因素[16]。然而NOX4在鼻咽癌中的作用尚不清楚。本研究发现NOX4在鼻咽癌组织中高表达，并与鼻咽癌患者的临床分期、复发和不良预后有关。这与在其他肿瘤中的发现一致。

有研究[3]表明，NOX4能够抑制肿瘤对放疗的敏感度，造成肿瘤对放疗抵抗。NOX4的下调可以抑制胶质母细胞瘤的增殖、侵袭及肿瘤相关血管生成，提高其体外放射敏感度[14]。使用NOX4抑制剂处理人类肾癌细胞可使细胞对放疗敏感[2]。NOX4的表达与鼻咽癌放疗敏感度的关系尚未见报道。文献中对于鼻咽癌放疗敏感和抵抗的定义并不统一。本研究采用Wu等[8]定义的标准：即根治性放疗后3个月复查，原发病灶和淋巴结无残留以及2年内无原发灶和颈部淋巴结复发定义为放疗敏感；而根治性放疗后3个月复查原发病灶和(或)淋巴结有残留以及2年内有原发灶和(或)颈部淋巴结复发定义为放疗抵抗。根据放疗敏感和抵抗的定义，将97例鼻咽癌患者分为放疗敏感组60例和放疗抵抗组37例，结果发现放疗抵抗组NOX4表达高于放疗敏感组。logistic 回归单因素、多因素分析表明NOX4是鼻咽癌放疗敏感度的独立预测因素，提示靶向抑制NOX4有望提高鼻咽癌患者对放疗的敏感度。

由于肿瘤细胞缺乏对放疗的敏感度，在放疗结束后，虽然组织学上无法检测到肿瘤，但一些微小病灶仍保留在原发部位，它们在生理上处于休眠状态，这些惰性细胞有可能因为突变获得新的致病力，是放疗后肿瘤复发的原因[17]。例如p16、fibulin-5、FLJ10540等基因的突变与鼻咽癌放疗后复发有关[18-20]。本研究收集2010～2018年在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院确诊的同一患者初发和复发鼻咽癌组织共22对，检测同一患者初发和复发鼻咽癌组织中NOX4的表达情况。发现同一患者复发后NOX4表达更高，进一步提示NOX4在鼻咽癌复发中起到作用。可能是因为NOX4降低了鼻咽癌放疗的敏感度，造成一些“微小病灶”的逃逸，导致了肿瘤的复发。然而在放疗过程中，基因突变和NOX4表达变化的机制仍需后续扩大样本量进一步深入研究。

综上所述，NOX4在人类鼻咽癌组织中高表达，且与肿瘤放疗敏感度、复发及生存预后相关。因此，靶向抑制NOX4有望提高鼻咽癌患者对放疗的敏感度，进而减少放疗后肿瘤残留和复发，改善鼻咽癌患者的生存预后。