甘薯根结线虫病病原——象耳豆根结线虫的鉴定

章淑玲， 欧高政， 陈美玲

(1.福建农业职业技术学院园艺园林学院，福建 福州350119；2.南安市天禾绿保农资有限公司，福建 泉州362300)

甘薯是重要的粮食作物，中国甘薯的种植面积和总产量均居世界第一，福建是中国最重要的甘薯主产区之一[1-2].甘薯根结线虫病是甘薯生产上的重要线虫病害，已报道的病原线虫有南方根结线虫(Meloido-gyne incognita)、北方根结线虫(M.hapla)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)等[3-4]，2014 年我国广东省湛江甘薯上发现了象耳豆根结线虫(M.enterolobii)[5].该线虫最早于1983 年在我国海南儋州象耳豆树上被发现、鉴定并命名[6]；随后其相继在我国广东、湖南、福建、云南等多个省份的不同作物上被发现[7].象耳豆根结线虫寄主范围广、致病力强，且能克服抗根结线虫的Mi 基因，已成为全世界热带及亚热带地区农作物生产上最具威胁性的重要病原之一[8-10].福建省的番石榴、荔枝[11]、胡萝卜、香蕉、生姜、辣椒和空心菜等作物上曾发现了该线虫的危害[12-15].2019 年福建省泉州石狮一块6 ～7 hm2的甘薯地发生了严重的根结线虫病，经调查取样、形态特征观察及分子生物学鉴定，明确其为象耳豆根结线虫，现将研究结果作如下报道.

1 材料与方法

1.1 样本采集

于2019 年8 月采集福建省泉州石狮发病地病薯(品种:湖南2 号)根部及根系周围的病土约500 g，分别放入封口袋内，并注明采集日期、地点、前茬作物和土壤类型等，带回实验室作进一步观察、分离与鉴定.

1.2 线虫种群纯化与保存

于体视显微镜(Nikon SMZ 745)下直接剖取甘薯病根中的单卵块，接种到预先培植在灭菌砂质土壤中长有两三片真叶的番茄苗根部，后置于18～30 ℃、13 h 光照的温室中培养60 d.

1.3 形态鉴定

用于形态鉴定的各虫态线虫均分离自单卵块繁育的番茄根结线虫种群.雌虫由体视显微镜(Nikon SMZ 745)下直接剖解番茄病根组织所得；雄虫通过改良贝尔曼漏斗法分离自染病番茄根部土壤；2 龄幼虫由番茄病根上单卵块孵化.线虫的杀死、固定及会阴花纹的制作参考张绍升[16]的方法.各形态线虫的体长、体宽、口针长、背食道腺开口至口针基部球的距离(DGO)、排泄孔至头端距离(EP)和尾长等重要形态分类特征值采用De Man公式进行计量[16].每一虫态取20 个样本.

1.4 分子鉴定

1.4.1 DNA 提取 甘薯根结线虫DNA 的提取参照陈淑君等[15]的方法.在体视显微镜(Nikon SMZ 745)下挑取1～3 条根结线虫2 龄幼虫，经灭菌ddH2O 清洗2～3 次后加入4 μL WLB 裂解液，用灭菌挑针将线虫切成2～3 段，用移液枪将线虫液吸到含有1.2 μL 蛋白酶K 和17 μL WLB 的Eppendorf 管中，于-20 ℃冰箱中冷冻过夜.次日放入PCR 仪中65 ℃消化60 min，95 ℃灭活10 min，10 000 r·min-1离心2 min.离心后的上清液直接用于PCR 扩增或置于-20 ℃冰箱中保存备用.

1.4.2 rDNA-ITS 序列分析 选用线虫rDNA-ITS 区PCR 扩增通用引物V5367(5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)和26S(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)[17]进行PCR 扩增.本试验所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.25 μL PCR 反应体系:2.0 μL DNA 模板，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，12.5 μL 10×PCR Master Mixture，8.5 μL ddH2O.扩增程序:94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s ，35 个循环；最后72 ℃延伸l0 min.取5 μL 扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行双向测序.将获得的rDNA-ITS 区序列与GenBank 数据库中常见根结线虫序列进行Blast 比对分析，并通过MEGA Ⅹ软件[18]中的MUSCLE 算法[19]比对，采用PhyloSuite 套件[20]中的IQ-tree[21]基于最大似然法(maximum likelihood， ML)构建系统发育树.分支上的可靠性经超快自展法(ultralfast bootsrap)10 000 次重复进行评估[22].

1.4.3 特异性引物检测 根据线虫形态与rDNA-ITS 序列分析结果，选用象耳豆根结线虫特异性引物Me-F(5′-AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG-3′)和Me-R(5′-TCAGTTCAGGCAGGATCAACC-3′)[23]对供试的甘薯根结线虫5 个DNA 样本进行PCR 特异性扩增.25 μL PCR 反应体系同1.4.2，扩增程序:94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38 个循环；最后72 ℃延伸10 min.取5 μL PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.

1.5 盆栽接种试验

选择健康的湖南2 号甘薯茎蔓，扦插于装有180 ℃高温灭菌砂质土壤的塑料盆(Ø=25 cm)内.待3～5 d植株成活后，于根部接种纯化培养的2 龄幼虫悬浮液(500 条·mL-1)5 mL，即每盆接种2 500 条；以不接种线虫为对照.接种处理与对照各10 盆，置于18～30 ℃、13 h 光照的温室中栽培50 d 后观察植株症状.

2 结果与分析

2.1 病害症状

田间甘薯受根结线虫严重侵染后，植株地上部常表现出叶片变黄或变红，生长缓慢，呈萎蔫状(图1A～B)；地下部薯块较小，表皮处常可见零散分布的大小不等的圆形或不规则形瘤状凸起，病薯剖开后无明显症状(图1C～D)；侧根上出现许多形状不一、表面粗糙的大小根结，有的根结连成块状肿瘤，直径为正常根系的2 倍以上，后期根系腐烂(图1E ～F).室内盆栽接种纯化的线虫50 d 后表现出与田间相似的症状(图1G～I).在体视显微镜(Nikon SMZ 745)下观察受害根部，可见近圆形的乳白色雌虫及卵块裸露或埋生于根组织内(图1J～L)，解剖卵块有时可见雄虫藏在其中(图1M).

图1 甘薯根结线虫病症状Fig.1 Symptoms of root-knot nematode disease on sweet potato

2.2 形态特征

雌虫:虫体膨大成球形或梨形，乳白色，有一明显突出的短颈，头架骨质化不明显.口针纤细，针锥稍短于针杆，排泄孔位于中食道球同一水平处(图2A).会阴花纹圆形或椭圆形，线纹细、较平滑，背弓高，呈近圆形或方形；侧线不明显，阴肛区无线纹(图2B～C).

雄虫:蠕虫形，体较长，体环明显，头架骨质化较明显，稍缢缩.口针较发达，针锥与针杆等长，基部球明显.排泄孔位置不定，后食道腺从腹面覆盖于肠前端(图2D).侧区有明显的4 条侧线；尾短，交合刺发达，无交合伞(图2E).

2 龄幼虫:蠕虫形，体细小，头架骨质化弱.口针纤细，针锥与针杆等长，基部球小.排泄孔位于后食道腺中部，后食道腺从腹面覆盖于肠前端(图2F).尾长锥状，有一清晰的透明区，末端钝圆，有1 ～3 个缢缩(图2G).

图2 供试甘薯根结线虫形态特征Fig.2 Morphological characteristics of root-knot nematode on sweet potato

本研究所分离纯化的甘薯根结线虫的形态测量值见表1，除雄虫测量值偏小外，其余虫态各测量值均与象耳豆根结线虫的原始描述[6]相符.因此，初步鉴定福建甘薯根结线虫为象耳豆根结线虫.

表1 供试甘薯根结线虫与象耳豆根结线虫原始描述群体的测量值比较1)Table 1 Comparison on the morphological measurements of root-knot nematode on sweet potato and the original records of M.enterolobii

2.3 分子生物学特征

利用通用引物V5367/26S 扩增供试甘薯根结线虫3 个DNA 样本的rDNA-ITS 区片段，扩增产物经测序后得到3 条均为765 bp 的序列，GenBank 登录号为MT406249 ～MT406251.Blast 比对分析显示，福建甘薯根结线虫与GenBank 中象耳豆根结线虫的同区域序列(MG773548 ～MG773551，KX823372 ～KX823382，MT209950～MT209955)相似性达99%～100%.由IQ-tree 构建的ML 系统发育树(图3)可以看出，福建甘薯根结线虫的3 个序列与象耳豆根结线虫位于同一分支，支持率为100%.

图3 基于rDNA-ITS 序列构建的ML 系统发育树Fig.3 ML phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence

利用特异性引物Me-F/Me-R 扩增甘薯根结线虫5个DNA 样本，得到236 bp 的特异性片段，不含DNA的阴性对照没有扩增条带(图4).该结果与文献[18]报道的片段大小一致，由此可确定福建泉州石狮甘薯根结线虫群体为单一种群，均为象耳豆根结线虫.

3 讨论

目前已报道的根结线虫有100 多种，各种类间的形态特征相似，为准确地鉴定根结线虫种类，往往需要将形态学与分子生物学方法相结合[7].本研究通过观察供试甘薯根结线虫不同虫态的形态特征，以及对线虫rDNA-ITS 区进行PCR 扩增、测序、序列比对与建树分析，同时结合种特异性引物扩增的结果，证实福建省泉州石狮甘薯根结线虫病的病原为象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobiiYang & Eisenback).这是福建省甘薯上发生象耳豆根结线虫的首次报道.该线虫致病力强，调查中发现发病田中80%以上的甘薯呈现受害症状，根系根结多，植株长势差，受害薯块呈明显畸形，薯块小且表面着生多个瘤状凸起，严重降低了甘薯的产量与价值.泉州石狮位于福建的南部地区(即闽南)，根据孟永攀[24]建立的象耳豆根结线虫潜在适生区预测模型，推测该地区是象耳豆根结线虫高度或中度适生区.此外，本研究中的发病地为砂质土壤，前茬作物为胡萝卜，福建多地已发现胡萝卜象耳豆根结线虫病[12，15]，这可能是此次甘薯象耳豆根结线虫病发生的重要原因.鉴于甘薯在福建省粮食作物中的重要地位及象耳豆根结线虫的危害性，今后农业部门应加强警惕该线虫在福建省尤其是闽南地区甘薯上的发生与流行，并及时做好线虫的预警、监测等相关工作.