脂多糖对裸鼹鼠肺脏组织影响的初探

张成财，刘尹航，陈 超，江文正

（1. 海军军医大学基础医学院实验动物学教研室，上海 200433；2. 上海外国语大学附属中学，上海 200083；3. 华东师范大学生命科学学院，上海 200241）

裸鼹鼠属于哺乳纲啮齿目裸鼹鼠属裸鼹鼠种，原产于非洲，主要以植物的根茎为食[1-2]。裸鼹鼠长期生活在地下2m左右的洞穴中，依靠身体上的触毛感受周围的环境。裸鼹鼠因具有对癌症的免疫能力等生物学特性，近年来越来越受到科研工作者关注[3]。

急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征是除心源性以外的各种肺内外致病因素所致的急性进行性呼吸功能衰竭[4]，多见于严重感染、休克、创伤等疾病的发生过程中，表现为以中性粒细胞为主的肺泡炎性细胞浸润、肺毛细血管内皮和肺泡上皮损伤导致的弥漫性肺水肿[5-6]。尽管现代医疗水平已经取得长足进步，然而急性呼吸窘迫综合征的病死率仍高达40%～68.5%[7-9]。因此，寻找更加有效的急性肺损伤治疗方法具有重大意义。本实验初步探讨腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对裸鼹鼠肺脏组织的影响，为进一步研究其机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12月龄健康雄性裸鼹鼠10只，由海军军医大学实验动物中心生产，饲养于屏障设施[SYXK（沪）2017-0004]。

1.2 实验动物分组与实验处理

10只裸鼹鼠随机分为对照组5只和实验组5只。实验前12 h裸鼹鼠禁食不禁水，称质量后实验组按体质量以10 mg/kg给药量腹腔注射LPS，对照组注射等体积的0.9%NaCl溶液（生理盐水）。

1.3 主要仪器设备及试剂

流式细胞仪购自美国Beckeman公司；烘箱购自上海精宏实验设备有限公司；自动组织脱水机、包埋机、转轮式切片机、染色机、封片机和倒置荧光显微镜等均购自徕卡显微系统（上海）贸易有限公司；活性氧检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；LPS购自美国Sigma公司。

1.4 实验方法

腹腔注射LPS 6 h后，按体质量以50 mg/kg给药量，腹腔注射0.375%戊巴比妥钠，麻醉处死裸鼹鼠。

1.4.1 肺脏组织切片的制备与观察 打开胸腔，取肺脏右侧下叶，置于通用型中性组织固定液中固定24 h。经脱水、透明、包埋、切片、染色、封固等步骤完成HE染色组织切片的制备，光学显微镜下观察。

1.4.2 肺组织湿干重比的测定 打开胸腔，取出肺脏左侧。PBS缓冲液冲洗干净，并用滤纸吸干。左肺置于电子天平称质量，计作湿质量。置于烘箱（80℃，48h）烤至质量恒定，称量后计为干质量。计算肺湿干质量比（=湿质量/干质量）。

1.4.3 肺组织细胞活性氧含量与凋亡检测 取右侧肺脏上叶和中叶，在超净台研磨提取细胞。用直径为70 µm的细胞筛滤过后，加入红细胞裂解液去除红细胞，调整细胞密度为1×106/mL。按照说明书方法添加检测试剂，流式细胞仪检测肺组织细胞活性氧含量（以平均荧光值表示）和凋亡率。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 LPS对裸鼹鼠肺组织湿干质量比的影响

与对照组（n=5）肺组织湿干质量比（5.10±0.20）比较，实验组（n=5）肺组织湿干质量比（5.04±0.14）未发生显著变化（P＜0.05）。

2.2 LPS对裸鼹鼠肺组织细胞氧化应激的影响

与对照组（n=5）肺组织细胞活性氧含量（19 913±4 700）比较，实验组（n=5）肺组织细胞活性氧含量（35325±2 989）显著升高（P＜0.05)。

2.3 LPS对裸鼹鼠肺组织细胞凋亡率的影响

流式细胞仪检测显示，与对照组比较，实验组肺组织细胞早期凋亡率未发生明显变化，晚期凋亡率显著升高（P＜0.01，图1）。

2.4 LPS对裸鼹鼠肺组织结构的影响

光学显微镜观察显示，对照组（图2A）和实验组（图2B）肺组织结构完整，肺泡孔内无明显渗出液和炎性细胞浸润。

图 1 裸鼹鼠肺组织细胞凋亡率Figure 1 Apoptosis rate of lung tissue cells in naked mole rats

图 2 裸鼹鼠肺组织病理学观察Figure 2 Pathological observation on lung tissues in naked mole rats

3 讨论

目前临床常见的感染以革兰阴性杆菌多见，其主要致病原是内毒素（endotoxin，ET），而LPS是内毒素的主要成分，故现在已不再区分LPS和ET[10-11]。有研究表明，腹腔注射一定剂量的LPS能够引起急性肺损伤[12]。急性肺损伤大致可以分为急性渗出期、亚急性纤维增殖期和慢性纤维化应答期[13]。急性渗出期主要表现为高通透性肺泡水肿、出血和血栓形成，影响通气血流比值和肺泡换气，表现为急性低氧血症[14-15]。主要病理改变为炎性反应和凝血反应，导致肺微血管内皮细胞和上皮细胞损伤，以及肺泡毛细血管膜屏障功能完整性的破坏[16]。机体在受到LPS刺激时，先产生非特异性免疫应答，主要通过循环和组织炎性细胞介导完成。这些炎性细胞在正常时没有活性，当受到病原刺激时，可以被快速激活，并通过产生炎性介质和活性氧等引起组织损伤[17]。

裸鼹鼠在自然状态下生活于封闭的地下洞道，不易与外界进行气体交换，致使洞道内长期维持低氧及高二氧化碳的气体环境[18-19]，在长期进化过程中，裸鼹鼠已经产生了一系列生理改变以适应这种气体环境。本实验给裸鼹鼠腹腔注射LPS，肺组织湿干质量比未发生显著变化，表明裸鼹鼠并没有发生急性肺损伤，病理学观察也验证了此结论；裸鼹鼠肺组织内活性氧含量显著升高，但是肺组织并未受到损伤，提示裸鼹鼠体内可能存在未发现的抗损伤机制；肺组织细胞晚期凋亡率显著升高，但是早期凋亡比例没有发生显著变化，这可能是由于裸鼹鼠肺脏组织中存在强大的细胞储备，在机体遭受损伤时，能够快速动员储备细胞，维持机体健康。

综上所述，虽然受LPS干预的裸鼹鼠肺脏组织中活性氧含量与晚期凋亡率显著升高，但是肺组织湿干质量比和肺组织细胞早期凋亡率并未发生显著变化，病理学观察也未见相应病变。结果表明，裸鼹鼠对LPS诱导的急性肺损伤有一定程度耐受，其具体机制有待进一步研究。