60Co γ射线辐射对裸鼹鼠肾脏、肺脏以及骨骼肌的影响

张静远，张倩倩，赵懿宁，杨 蓉，张成财 ，贺辰囧，袁 征，崔淑芳#

（1. 海军军医大学基础医学院实验动物学教研室，上海 200433；2. 上海市杨浦区精神卫生中心医技科，上海 200090；3. 军事科学院军事医学研究院实验动物中心，北京 100071）

裸鼹鼠（naked mole rat）属于哺乳纲啮齿目豪猪亚目滨鼠科裸鼹鼠属裸鼹鼠种，原产于非洲，以植物的根茎为食[1-2]。裸鼹鼠长期生活在地下2m的洞穴中，视力几乎丧失，依靠身体与嘴两侧的触毛感受周围的环境。裸鼹鼠具有抗肿瘤、抗衰老、耐低氧及耐疼痛等特性，近年来已引起各国科研工作者的广泛关注[3]。

电离辐射对生物体的影响是目前生物医学研究领域的热点之一。研究显示，辐射能够引发生物体多个组织的损伤，如γ射线辐射后ICR小鼠出现骨髓铁沉积现象[4]；BALB/c小鼠胸腔辐射模拟可导致肺脏功能细胞大量坏死，肺脏严重纤维化[5]；7 Gy辐射C57BL/6J小鼠后，诱发原发性结肠炎症及严重的功能障碍[6]。本课题组前期研究发现，裸鼹鼠在活体水平具有天然的辐射耐受能力[7]，肾脏、肺脏和骨骼肌作为机体内的重要器官和组织，在内环境稳定以及生命活动中发挥着重要作用。因此，本实验以裸鼹鼠为研究对象，检测辐射后肾脏、肺脏和骨骼肌的组织学变化，以及氧化应激指标变化，初步探讨辐射对裸鼹鼠的影响，以期为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

18月龄健康雄性裸鼹鼠21只，由海军军医大学实验动物中心生产，饲养于屏障设施[SYXK（沪）2017-0004]。

1.2 实验动物分组与实验处理

21只裸鼹鼠随机分为2组，分别为对照组7只和实验组14只。实验组裸鼹鼠给予全身一次性60Co γ射线辐射，辐射剂量率为1.163 Gy/min，辐射时间为8.6 min，总辐射剂量为10 Gy，由海军军医大学辐照中心完成。

1.3 主要仪器设备及试剂

自动组织脱水机、包埋机、转轮式切片机、染色机、封片机和倒置荧光显微镜等均购自徕卡显微系统（上海）贸易有限公司。生化检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 肾脏、肺脏和骨骼肌组织切片的制备与观察 分别取对照组、辐射后7 d和14 d实验组各3只裸鼹鼠，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉，迅速取下腓肠肌，打开腹腔，取出肾脏、肺脏，置于通用型中性组织固定液中固定24 h。经脱水、透明、包埋、切片、染色、封固等步骤完成HE染色组织切片的制备，光学显微镜下观察。

1.4.2 肾脏、肺脏和骨骼肌组织氧化应激指标检测 分别取对照组、辐射后7 d和14 d实验组各4只裸鼹鼠，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉，迅速取下腓肠肌，打开腹腔，取出肾脏、肺脏。剪取0.1 g组织制备匀浆，经40 µm孔径筛网研磨过滤后加入1 mL裂解液，12 000×g，4℃离心10min，取上清液用于检测丙二醛（maleicdialdehyde，MDA）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量，检测步骤参照试剂盒说明书。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件进行分析处理。各实验所得数据以x-±s表示，使用Graphpad Prism 5.0软件对数据进行分析作图。多组比较先进行方差分析，再采用Bonferroni法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学观察

2.1.1 肾脏 光学显微镜下观察发现，对照组肾脏细胞清晰完好，肾小球未见病变，基底膜完整（图1A）。辐射后7 d及14d，镜下可见肾脏细胞大小正常，未出现炎性反应和明显的水肿、坏死等病变（图1B、C）。

2.1.2 肺脏 光学显微镜下观察发现，对照组裸鼹鼠肺脏组织肺泡结构清晰，肺泡大小正常（图1D）。辐射后未出现肺泡腔渗出液和出血、成纤维细胞增生、肺组织局灶性实变等病变，但偶见肺泡间隔轻微增厚，少量炎性细胞浸润（图1E、F）。

2.1.3 骨骼肌 光学显微镜下观察发现，对照组裸鼹鼠骨骼肌形态结构完整，肌纤维呈细条状整齐平行排列（图1G）。辐射后肌纤维呈圆形或多边形，细胞核位于周边；肌纤维相互平行排列，聚集成束，其周围包有结缔组织，即肌束膜；大小不等的肌束聚集在一起构成肌肉，其周围包有致密的结缔组织，即肌外膜；均未见肌纤维萎缩、坏死或者纤维化（图1H、I）。

2.2 氧化应激指标检测

2.2.1 肾脏 肾脏组织中MDA含量在辐射后7 d明显高于对照组（P＜0.01），辐射后14d较对照组、辐射后7d有明显升高（P＜0.01）。T-AOC与GSSG含量在辐射后未见明显变化。GSH含量在辐射后7 d较对照组明显升高（P＜0.05），辐射后14 d较对照组、辐射后7 d明显降低（P＜0.05）（表 1）。

图 1 60Co γ辐射后不同时间裸鼹鼠肾脏（A～C）、肺脏（D～F）、骨骼肌（G～I）组织学观察Figure 1 Histopathological observation on the kidney (A-C), lung (D-F) and skeletal muscle (G-I) tissues of naked mole rats at different time points after 60Co γ radiation

2.2.2 肺脏 肺脏组织中的MDA含量在辐射后7 d明显高于对照组（P＜0.05），辐射后14d较对照组、辐射后7 d有明显升高（P＜0.005）。T-AOC在辐射后7 d、辐射后14 d均低于对照组（P＜0.005，P＜0.01）。GSH含量在辐射后7d与对照组相比明显降低（P＜0.005），辐射后14 d较对照组、辐射后7d有显著升高（P＜0.01，P＜0.05）。GSSG含量在辐射后7 d与对照组相比明显降低（P＜0.05），辐射后14 d较对照组、辐射后7d有明显升高（P＜0.01）（表1）。2.2.3 骨骼肌 骨骼肌中MDA含量在辐射后7 d明显高于对照组（P＜0.01），辐射后14d明显低于辐射后7 d（P＜0.01），但仍明显高于对照组（P＜0.01）。T-AOC在辐射后7 d和14 d均明显低于对照组（P＜0.01）。GSH和GSSG含量在辐射后7d与对照组相比明显降低（P＜0.01），辐射后14 d均明显高于对照组、辐射后7 d（P＜0.01）（表 1）。

表 1 60Co γ射线辐射对裸鼹鼠肾脏、肺脏、骨骼肌氧化应激指标的影响Table 1 Effects of 60Co γ-ray radiation on indicators of oxidative stress in kidney, lung and skeletal muscle of naked mole rats

3 讨论

在人类生存环境中，辐射无处不在，除天然辐射外，工业核污染、医疗放射以及日常生活中的电器辐射，均可对人类造成不同程度的辐射损伤[8-9]。其中，天然辐射和医疗放射是造成人类辐射损伤的主要辐射来源，当辐射达到一定剂量，会产生急性放射病，导致器官损伤，细胞癌变概率增加[10]。因此，开展辐射损伤防治研究具有重要的现实意义。

目前辐射相关的研究主要围绕小鼠、大鼠和小型猪等。王敏等[11]研究发现，昆明小鼠在受到5 Gy X 射线全身辐射后，会发生肾小球肿胀，肾小管和集合管上皮细胞空泡化、凋亡、坏死。周中林等[12]研究发现，C57BL/6小鼠在受到6 Gy60Co γ一次性全身辐射后，肺组织网状结构不清晰，肺泡间隔断裂，部分肺泡融合。陈超等[7]研究发现，小鼠在经少量多次辐射之后，骨组织骨髓腔内红骨髓减少，间质细胞炎性浸润。在本研究中，裸鼹鼠经过60Co γ射线10 Gy一次性全身辐射后，镜下可见肾脏细胞大小正常，未出现炎性反应以及明显的肿胀、凋亡、坏死等病变；肺脏组织肺泡结构清晰，肺泡大小正常，仅偶见肺泡间隔轻微增厚，有少量炎性细胞浸润，未出现肺泡腔渗出液和出血、成纤维细胞增生、肺组织局灶性实变等病变；未观察到骨骼肌纤维萎缩、坏死和纤维化，间质细胞炎性浸润等变化。结果表明辐射对裸鼹鼠肾脏、肺脏和骨骼肌影响较小，提示受到辐射刺激后的裸鼹鼠肾脏、肺脏和骨骼肌仍然能够维持良好的稳定性。与小鼠以及其他实验动物构建的辐射损伤模型相比，裸鼹鼠这一独特的生物学特性或可为后期辐射损伤防治研究提供参考。

辐射损伤效应除表现在组织学，还表现在分子水平上，主要表现为化学键破坏诱发的水分子、DNA、蛋白质等电离。水分子在电离时可产生活性氧簇和活性氮自由基，改变细胞正常氧化过程而损害健康[13-14]。脂质过氧化的终产物MDA是机体受到氧化损伤的重要标志[15]。本研究中辐射后裸鼹鼠肾脏、肺脏和骨骼肌中MDA含量均明显升高（P＜0.01），表明氧化自由基在裸鼹鼠体内迅速积累，发生明显的氧化应激反应。GSSG和GSH是机体内重要的抗氧化和自由基清除剂，正常情况下机体以GSH形式存在为主，GSH含量是衡量机体抗氧化能力大小的重要指标[16-17]。辐射后裸鼹鼠肺脏、骨骼肌中GSH和GSSH水平在7 d时出现明显降低，提示抗氧化物质消耗；但与小鼠的情况[18]不同的是，裸鼹鼠GSH和GSSH水平在辐射后14 d出现明显回升，表明裸鼹鼠可能在受到氧化应激损伤后，通过提高体内抗氧化产物表达水平来提高裸鼹鼠耐受辐射的能力。裸鼹鼠肾脏GSH水平在辐射后7 d时显著增高，14 d显著下降；GSSG没有发生显著变化，较肺脏和骨骼肌而言，裸鼹鼠肾脏能迅速提高抗氧化能力来抵抗氧化损伤。T-AOC反映的是机体总体的抗氧化能力，其数值的高低反映机体抗氧化能力的强弱[16]。与对照组相比，辐射后裸鼹鼠肾脏T-AOC在没有明显变化，肺脏T-AOC在辐射7 d后水平明显降低，但在14 d已经回升并接近对照组，骨骼肌T-AOC在14 d仍然维持7 d水平，提示裸鼹鼠机体有较强的抗氧化能力恢复力，帮助机体抵抗辐射损伤。

综上所述，辐射后裸鼹鼠肾脏、肺脏和骨骼肌发生明显的氧化应激反应，但在组织学观察时并未发现相应的病理损伤。一方面表明裸鼹鼠对辐射具有一定程度的耐受能力，另一方面也表明裸鼹鼠体内还存在其他尚未明确的过氧化清除机制，这为后续研究裸鼹鼠耐辐射机制奠定了基础。