60Co γ射线辐射对裸鼹鼠脾脏的影响

杨 蓉，赵懿宁，杨文静，赵善民，柴宇静，张成财，袁 征，崔淑芳#

（1. 海军军医大学基础医学院实验动物学教研室，上海 200433；2. 上海市杨浦区精神卫生中心医技科，上海 200090；3. 军事科学院军事医学研究院实验动物中心，北京 100071）

随着核能和核技术在医疗卫生、工农业生产、科学研究和国防中大量应用，辐射的危害已不容忽视。目前，辐射耐受相关研究主要采用小鼠和大鼠、非人灵长类动物、小型猪、犬、秀丽隐杆线虫等进行[1-4]，但上述模型动物并不具有辐射耐受特性，只是单纯作为人类的替代进行辐射损伤的模拟，无法对辐射损伤防护提供有利的参考。裸鼹鼠是一种具有多种生物学特性的新型实验动物，如抗衰老、抗肿瘤、耐低氧、耐疼痛等特性。本课题组前期研究发现，相较于小鼠、大鼠等动物，裸鼹鼠具有更强的辐射耐受能力[5]，利用裸鼹鼠或许有助于更好地探索抗辐射相关机制。

电离辐射是由直接或间接电离粒子或二者混合组成的波长小于100 nm的电磁辐射，能使受作用物质发生电离现象。电离辐射的特点是波长短、频率高、能量高的射线。辐射可对机体多种组织器官造成损伤。作为机体最大免疫器官的脾脏，对辐射损伤较为敏感。前人研究发现，辐射会导致小鼠脾脏组织内氧化应激失衡[6]，脾脏超微结构改变[7]，脾脏淋巴细胞功能异常[7-9]，脾脏全基因组DNA甲基化水平降低[10]，脾脏细胞周期和凋亡节律改变[11]。本课题组前期研究结果表明，裸鼹鼠与小鼠的脾脏在解剖学、组织学和超微结构上都具有较大的差异[12]。本研究观察10 Gy60Coγ射线照射对裸鼹鼠脾脏功能的影响，为研究裸鼹鼠耐辐射机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

18月龄健康雄性裸鼹鼠28只，由海军军医大学实验动物学教研室生产，饲养于屏障设施[SYXK（沪）2017-0004]。

1.2 实验动物分组与实验处理

28只裸鼹鼠随机分为2组，分别为对照组7只和实验组21只。实验组裸鼹鼠给予一次性全身60Co γ射线辐射，辐射剂量率为1.163 Gy/min，辐射时间为8.6 min，总辐射剂量为10 Gy，由海军军医大学辐照中心完成。

1.3 主要仪器设备及试剂

荧光标记流式用抗体购自美国Biolegend公司；氧化应激指标测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 脾脏淋巴细胞的分离 分别取对照组、实验组辐照后7 d、14 d和21 d各3只裸鼹鼠，通过腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉裸鼹鼠，打开胸腔，取脾脏，迅速置于预冷的PBS液中剪碎，研磨脾脏获取细胞悬液，经 200目筛网过滤细胞悬液，离心（1 500 r/min，4℃）5min，弃上清液；加入红细胞裂解液5mL混匀，静置5 min，离心（1 500 r/min，4℃）5min弃上清液；用5 mLPBS清洗2次，每次离心（1500 r/min，4℃）5 min 后弃上清液；用PBS 将其制成细胞悬液，并调整细胞密度至 1×106个/mL，用于后续检测。

1.4.2 B细胞亚群的检测 取100 µL淋巴细胞悬液，加入 1 µL FITC 抗小鼠 CD3 和 1 µL APC 抗小鼠 CD19，细胞荧光染色30 min。设置单染及空白对照管；加入PBS1mL，振荡混匀，1 500 r/min 离心2 min，去上清液；加入PBS 200µL，振荡悬浮细胞，进行流式检测。

1.4.3 巨噬细胞亚群的检测 取100 µL淋巴细胞悬液，加入1 µL PE 抗小鼠 CD11b，细胞荧光染色30 min。设置空白对照管；加入PBS 1 mL，振荡混匀，1 500 r/min 离心2 min，去上清液；加入PBS 200 µL，振荡悬浮细胞，进行流式检测。

1.4.4 脾脏组织氧化应激水平检测 分别取对照组、实验组辐照后7 d、14 d和21 d各4只裸鼹鼠，通过腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉裸鼹鼠，迅速打开胸腔，取脾脏，剪取0.1g脾脏组织，经40 µm孔径筛网研磨过滤后加入1 mL裂解液，12 000×g，4 ℃离心10 min，取上清液用于检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）、总抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidative glutathione，GSSG）含量，检测步骤严格参照试剂盒说明书。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 辐射对裸鼹鼠脾脏免疫细胞的影响

从图1、表1可见，裸鼹鼠经10 Gy60Co γ射线全身照射后，与对照组相比较，辐照后7 d裸鼹鼠脾脏组织中CD3-CD19+B淋巴细胞的比例有轻微下降，差异没有统计学意义，但辐照后14 d、21 d显著高于对照组（P＜0.01）。辐照后7 d、14 d、21 d 裸鼹鼠脾脏中CD11b+巨噬细胞的比例显著高于对照组（P＜0.01），表明辐照未对裸鼹鼠脾脏组织的免疫系统造成损伤。

2.2 辐射对裸鼹鼠脾脏氧化应激水平的影响

与对照组相比较，辐照后7 d 脾脏组织中MDA含量明显升高（P＜0.05）；随着辐照时间延长，脾脏组织中MDA含量仍在增加，辐照后21 d 显著高于对照组（P＜0.01）。辐照后7d脾脏组织中GSH与GSSG含量均有轻微降低，但与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；辐照后14 d、21 d GSH与GSSG含量均明显降低（P＜0.05）。T-AOC水平于辐照后7d和14 d均显著降低（P＜0.01），辐照后21 d有所上升，明显高于辐照后7 d和14 d（P＜0.01），但仍低于对照组（P＜0.01）（表2）。

图 1 流式细胞术检测裸鼹鼠脾脏免疫细胞Figure 1 Flow cytometry tests for immune cells in spleen of naked mole rats

表 1 辐射对裸鼹鼠脾脏免疫细胞的影响Table 1 Effects of radiation on immune cells in spleen of naked mole rats

表 2 辐射对裸鼹鼠脾脏氧化应激水平的影响Table 2 Effects of radiation on oxidative stress in spleen of naked mole rats

3 讨论

脾脏是机体最大的免疫器官，是成熟淋巴细胞定居的场所。Paranich等[13]发现，小鼠脾脏细胞在2 Gy γ射线照射后开始失去功能活性和形态结构特征，且随着辐射剂量的增加，这些变化过程越明显。淋巴细胞是对辐射最敏感的细胞群之一，是放射损伤早期诊断的重要参考指标。Anderson等[14]发现电离辐射能引起免疫系统和淋巴细胞的严重损伤；Harrington 等[15]发现电离辐射能引起 T、B细胞迅速减少，对丝裂原的反应能力明显降低；何颖等[16]研究发现，1 Gy60Coγ射线全身照射24 h后，小鼠脾脏B淋巴细胞比例显著降低，说明电离辐射导致小鼠脾脏B淋巴细胞数量减少，辐射对小鼠免疫功能造成了损伤。本课题组预实验发现，辐照后15 d内全部小鼠陆续死亡。本研究结果显示，辐照后7 d裸鼹鼠脾脏 B 淋巴细胞比例有轻微下降，但辐照后14 d、21 d裸鼹鼠脾脏B淋巴细胞比例均明显高于对照组；与对照组相比，辐照后巨噬细胞比例明显升高，提示辐照后裸鼹鼠脾脏免疫系统可以做出相应的免疫应答，表明辐照未对裸鼹鼠脾脏造成严重损伤，不影响其发挥免疫应答功能。

脂质过氧化代谢产物MDA的含量反映活性氧在体内的积累情况。GSH和GSSG作为机体内重要的抗氧化和自由基清除剂，反映机体清除活性氧的能力。左丽丽等[17]发现，小鼠经6Gy的60Co γ射线照射后，其脾脏组织MDA含量显著增加，表明6 Gy的辐射剂量导致小鼠脾脏组织产生了明显的脂质过氧化反应；李辉等[18]发现，小鼠经7 Gy60Co γ射线照射后，其脾脏组织中GSH含量显著降低。本研究发现，辐照后7 d 裸鼹鼠脾脏组织MDA水平明显升高，随着辐照后时间延长，裸鼹鼠脾脏组织MDA水平进一步升高，表明辐照后脾脏组织发生了明显的脂质过氧化反应。随着活性氧在体内的积累，辐照后裸鼹鼠脾脏组织中GSH和GSSH水平均明显降低，体现了抗氧化物质的消耗，与小鼠研究结果一致。T-AOC反映机体总体的抗氧化能力，辐照后7 d裸鼹鼠脾脏组织T-AOC明显降低，表明裸鼹鼠脾脏组织总体抗氧化能力下降，但辐照后21 d 裸鼹鼠脾脏组织T-AOC出现了相当程度的回升，表明裸鼹鼠在遭受氧化应激损伤后脾脏组织总体的抗氧化能力得到较大恢复。

综上所述，本研究发现，虽然MDA的积累提示裸鼹鼠脾脏出现了氧化应激损伤，但辐照后21d裸鼹鼠脾脏组织总体的抗氧化能力逐渐恢复，且辐照并未影响脾脏B淋巴细胞发挥免疫应答功能。结果表明裸鼹鼠脾脏组织确实具有一定程度的辐射耐受能力，另一方面也说明裸鼹鼠脾脏组织中还可能存在其他尚未明确的抗氧化修复机制。本研究结果为进一步探讨裸鼹鼠抗电离辐射机制提供了参考。