少弱精子症ICSI受精失败后行补救性卵母细胞辅助激活成功妊娠1例

黄玉芳，杨丽娟，陈胜辉，刘淑娟，孙迎利

(南昌市生殖医院，南昌 330000)

卵胞浆内单精子注射(ICSI)是指将精子直接注射入卵母细胞胞质内的辅助受精显微操作技术，其在严重少精子症、弱精子症、畸精子症，以及经皮附睾穿刺取精及睾丸穿刺取精的梗阻性无精子症患者中得到了广泛应用。ICSI技术为这些患者带来了福音，该技术能够显著提高受精率，然而仍有少部分的ICSI周期会发生完全受精失败或受精率极度低下的病例[1-2]。在辅助生殖技术中，激活卵母细胞是受精中的关键环节，是生殖医学中的重要研究内容，受精失败最主要原因就是未成功激活卵母细胞[2-5]。针对ICSI后次日原核观察发现完全不受精或者低受精率的周期，目前各大中心并无好的解决方案，该周期基本无可用胚胎。关于补救性化学激活卵母细胞案例更是较少相关报道[6]。现将1例因男方少弱精子症行ICSI，次日原核观察发现受精失败后进行卵母细胞辅助激活(AOA)获得早期囊胚1枚且新鲜移植，成功顺产1名健康男婴的病例报道如下。

一、病例资料

患者夫妇女方27岁，男方28岁。夫妇二人于2014年生育1名健康女孩。之后女方2015年人工流产1次，2016年自然流产1次。近5年来一直未采取避孕措施，性生活正常规律，每周1～2次。女方曾于2018年行输卵管造影(HSG)检查，提示宫腔正常，左侧输卵管伞端阻塞粘连，右侧输卵管峡部阻塞。2019年患者夫妇因不孕症来我院就诊，行宫腹腔镜探查术，术中诊断双侧输卵管积水、女性盆腔粘连；术中行腹腔镜双侧输卵管切除术和宫腔粘连松解术，宫腔镜探查未见明显异常。女方平素月经规律，周期30 d，经期5 d，经量中色暗红无痛经，无传染病史。男方无传染病史及手术史，亦无不良嗜好，男科检查前列腺未见异常，双侧睾丸大小正常，阴茎及射精功能正常。精液检查结果：精子浓度为2×106/ml、活动率为5%、前向运动精子率为2%、非前向运动精子率为3%，诊断为少弱精子症。夫妻双方染色体检查均正常。

女方促排卵方案为改良超长方案，取卵当日共获卵15枚，其中成熟卵母细胞10枚、未成熟卵母细胞5枚。男方于取卵当日手淫取精，精液液化后进行精液处理，精子浓度低，活动度差。卵母细胞脱颗粒孵育30 min后取成熟卵母细胞10枚行ICSI。ICSI过程中卵母细胞形态未见异常，其中2枚卵母细胞无弹性；挑选形态尚可、活动度好的精子制动后分别注入卵母细胞内，制动和注射过程均顺利。次日观察受精情况，10枚成熟卵母细胞中的2枚无弹性卵母细胞退化，其余8枚卵母细胞未见原核形成。告知患者后建议选择AOA进行受精补救，患者同意补救性AOA措施并签署知情同意书后，立刻行离子霉素(Ionomycin，Ion)化学激活。AOA具体操作步骤为：将未受精的卵母细胞置于含10 μmol/L Ion的取卵-胚胎处理液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)中避光处理10 min，经卵裂胚培养液(G1 Plus，Vitrolife，瑞典)洗涤5～6次，然后转入卵裂胚培养液中继续培养。第3天观察发现8枚化学激活的卵母细胞共有7枚发生卵裂，其中3级2枚、4级2枚，发育缓慢3枚。7枚卵裂胚胎全部行囊胚培养，第5天获得融合胚胎2枚，余退化；第6天2枚融合胚胎中的1枚退化，另1枚发育成早期囊胚。应患者要求进行新鲜移植。术前告知患者移植由AOA发育而来的囊胚可能存在的风险，患者签署知情同意书并继续要求新鲜移植。早期囊胚移植7 d后检测患者血HCG为33.42 U/L，移植45 d后B超显示单胎妊娠，胎心胎芽皆可见，最后于孕39+2周剖腹产下1名男婴，体重4.2 kg，身长50 cm，查体未见异常。

二、讨论

未成功激活卵母细胞是受精失败的最主要原因[2-5]。Ca2+振荡在AOA过程中起十分重要的介导作用[7]。目前Ca2+振荡发生原理主要集中在受体控制学说和可溶性精子蛋白学说两方面[8-9]。大量研究使用电激活、物理激活或化学激活等激活方法来增加AOA所需的Ca2+，以成功激活行ICSI后的卵母细胞[10]。现各大生殖中心主要使用化学激活法进行AOA[11-13]，因为化学激活剂易购买、质量易保证、操作方法简单易学易开展，且激活后受精率高、卵裂率高，能够有效提高周期可用胚胎率。不同的激活试剂的激活原理不同，Ion是一种链霉菌属的抗生素，对Ca2+有高效亲和力的离子载体，Ion不是直接引起Ca2+的跨膜转运而是通过间接降低细胞内的Ca2+浓度来激活卵母细胞[14]。相比Ca2+载体A23187，Ion的化学激活功能特异度更高、效果更好，但它的功能还有待进一步研究。有研究发现高浓度Ion会引起Ca2+振荡频率与幅度的上升进而打破线粒体能量代谢平衡，导致活性氧自由基(ROS)升高和腺苷三磷酸(ATP)下降，从而诱发DNA损伤、降低囊胚形成率[15]。现在哺乳动物中广泛使用的AOA方案中Ion的使用浓度为10 μmol/L，作用时间为10 min。

虽然化学激活剂能够改善卵裂率和可用胚胎率，但在临床使用中仍然存在后代安全性如有害、致畸等方面的质疑。Vasilev等[14]运用5 μmol/L(相当于哺乳动物的10 μmol/L)的Ion作用海星卵母细胞10 min后发现，对照组有(88.3±1.4)%卵裂正常，实验组只有(24.8±10.9)%卵裂正常；实验组受精卵要么停滞在第1次卵裂期，要么呈现异常卵裂；在随后的发育过程中对照组(68.3±16.1)%卵裂胚形成正常可用囊胚，而实验组仅有(16.2±19.3)%卵裂胚形成正常可用囊胚。Heytens等[16]对7～12周B6D2F1小鼠进行控制性促排卵获得的卵母细胞行Ion化学激活发现，Ion最佳作用浓度亦为10 μmol/L，但是Ion处理组和对照组在囊胚发育、内细胞团和滋养层细胞数目、囊胚着床率和新生胎鼠参数如体长、重量、形态等方面比较均无显著差异。Norozi-Hafshejani等[17]发现，相比氯化锶而言Ion有更强的卵母细胞激活功能，但是在胚胎发育上，氯化锶处理组细胞碎片率显著低于Ion处理组，这可能跟二者激活原理有关，Ion可以引起Ca2+浓度快速升高，而氯化锶对Ca2+作用比较温和，只是引起Ca2+浓度的微量、缓慢上升，但两组胚胎着床率比较并无显著差异。国内檀畅等[12]运用氯化锶激活卵母细胞的研究发现，ICSI联合氯化锶辅助激活15枚成熟卵母细胞，虽然仅有4枚胚胎正常受精，但是形成了3枚可用胚胎，融胚移植并成功顺产1名健康男婴，其结果与Norozi-Hafshejani等[17]的研究结果一致。Nasr-Esfahani等[18]研究发现，对因男方是重度畸形精子症而就诊的87对夫妇运用ICSI联合Ion激活卵母细胞时，行AOA可以有效改善卵裂率并提高可用胚胎率；运用植入前遗传学诊断(PGD)技术对获得的胚胎进行遗传学分析发现，可获得含正常染色体的胚胎，成功妊娠1年后随访子代，体检并未发现子代有身体及智力障碍等问题。Li等[19]发现ICSI联合AOA(ICSI-AOA)虽然可以通过提高生育率和可移植胚胎率来弥补ICSI受精失败，但是不能显著提高囊胚形成率、妊娠率和移植率。Vanden Meerschaut等[20]发现，在由于精子因素导致ICSI受精失败的案例中行ICSI-AOA能有效改善囊胚形成率和妊娠结局，而对于非精子因素导致的受精失败案例则不能影响囊胚形成率和妊娠结局。

本案例中夫妇双方曾生育1名女孩且有2次流产史，男方精液检查为少弱精子症，且女方亦存在宫腔环境问题，所以：(1)无法预先判断ICSI能否正常受精；(2)直接进行ICSI-AOA也不能保证一定受精；(3)该技术还存在一定的风险，故没有当天ICSI后即进行AOA技术。ICSI次日观察受精失败后进行补救性AOA，受精率显著提高并获得可用胚胎，新鲜移植获得妊娠后成功产下1名健康男婴。这为我们提供了一个新的思路：ICSI受精失败后可采取补救性AOA以提高卵母细胞受精率和可利用胚胎率。但从案例中我们也发现由于是在ICSI第2天进行AOA，存在卵母细胞老化且胚胎发育偏慢、优质胚胎率低等问题。所以，如果该对夫妇还有生育要求，下次可于ICSI当日即进行AOA，以保证受精率，提高临床可用胚胎率。

综上所述，对于ICSI助孕受精失败的患者，可以实行补救性AOA方案，以帮助患者获得可用胚胎。目前临床上运用化学激活剂进行AOA都是个案报道，缺乏大样本研究加以证实，且所获得的胚胎可能存在发育潜能问题。为保障患者权益，在向患者介绍该项技术优越性的同时也要向其详细说明面临的风险以及对子代健康可能产生的影响，充分尊重患者的选择。本研究行ICSI后获得的可用卵母细胞仅8枚，且没有设置对照组进行验证，所以后期一方面要对生产的男婴健康状况定期随访，另一方面要加大研究力度，收集更多病例数据进行深入分析以探讨和评估该技术的安全性，更好地为患者服务。