干腌火腿中生物活性肽功能特性研究进展

李 平，杨 婷，周 辉,，聂 文，徐宝才，王兆明，陈顺通

（1.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009；2.合肥师范学院电子信息与电气工程学院，安徽 合肥 230601；3.金字火腿股份有限公司，浙江 金华 321000）

干腌肉制品在世界上具有悠久的历史，其特殊的加工过程赋予了肉制品独特的风味，我国的腌腊肉制品如干腌火腿、腊香肠、板鸭板鸡等产品享誉国内外。具有“四大名腿”之称的浙江金华火腿、云南宣威火腿、江苏如皋火腿以及湖北宣恩火腿采取中式火腿传统制作工艺，原料腿经过选择、腌制、洗晒、整形，然后历时几个月的发酵以及堆叠后熟，形成色香味齐全的干腌火腿产品。在国外，意大利的帕尔马火腿、西班牙的伊比利亚火腿和法国的巴约纳火腿历史悠久，各具特色，也深受消费者喜爱。

生物活性肽是指除具有基础的营养功能外，还可在生物体内起重要的生理作用、发挥特定生理功能的多肽类物质[1]。生物活性肽具有抗氧化、抑制细菌病毒、抗癌、降胆固醇、抗高血压、抗糖化、抗血栓、抗心血管硬化、免疫调节等作用，同时对心理疾病、糖尿病、肥胖有一定的治疗功效[2-3]。干腌肉制品加工工艺独特而且加工过程漫长，肌肉中蛋白质降解程度高，富含各类肽，为天然生物活性肽的重要来源。例如，金华火腿成熟完成后，火腿中整体蛋白质的降解率约达到22.1%，其中肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的降解比例较高，分别占62.07%和46.15%[4]。目前，国内外针对干腌火腿生物活性肽的研究集中在各类肽的功能特性研究和活性肽的分离纯化及鉴定，关于生物活性肽形成机理的研究，目前普遍认为火腿内源酶在加工过程中活性肽的产生方面发挥主要作用。本文着重综述近年来国内外对干腌火腿中多肽的生物活性研究进展和形成机理，旨在为基于干腌火腿的生物活性肽研究提供新思路和新方向。

1 干腌火腿中活性肽的形成机理

干腌肉制品的加工过程比较复杂而且加工时间长，期间内源酶在肉成熟过程中对多种蛋白质存在明显的降解作用，这些蛋白质的降解是肉中各类肽形成的重要来源。引起这些变化的酶包括组织蛋白酶B、D、H、L和外肽酶（肽酶和氨肽酶），一定程度上钙蛋白酶也参与其中[5]。在后期漫长的发酵及后熟过程中，微生物酶解与肉制品内源酶酶解的共同作用主导了蛋白质降解的过程[6]，而这一过程先是由内肽酶对蛋白质进行降解，随后伴随着外肽酶的作用，蛋白质最终被分解为肽以及游离氨基酸。

1.1 干腌火腿加工过程中蛋白质降解规律

在火腿制作过程中，原料肉需经过腌制、晾晒、发酵和后熟等工艺，在这过程中蛋白质持续发生降解最终生成各类肽和游离氨基酸，而在整个加工过程中不同时期活性肽的活性和含量均存在较大差异。邵靖萱等[7]的研究表明宣威火腿在不同的加工阶段提取得到的抗氧化肽活性和含量不同，而且活性在前期（0～2 个月）和后期（6～8 个月）显著升高。王勇勤等[8]的研究表明在火腿成熟阶段提取得到的抗氧化肽活性最强。各类活性肽来源于肌肉蛋白质的降解，黄明等[9]论述了在肌肉宰后成熟过程中部分肌原纤维蛋白在内源酶的作用下会发生有限降解，这些蛋白主要包括肌连蛋白（titin）、伴肌动蛋白（nebulin）、结蛋白（desmin）、肌钙蛋白-T（troponin-T）和抗肌萎缩蛋白（dystrophin）。干腌火腿蛋白质降解主要发生在肌原纤维蛋白中，其中结蛋白、肌连蛋白、伴肌动蛋白消失，最终形成多肽[10]。di Luccia等[11]通过采用双向电泳研究干腌火腿成熟过程中肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的降解情况，结果表明肌动蛋白、原肌球蛋白与肌球蛋白轻链在火腿加工成熟过程中含量逐渐减少至消失。Monin等[12]对法国巴约纳火腿的肱二头和半膜肌蛋白降解进行研究，结果表明肌原纤维各分类蛋白除肌动蛋白外均发生降解，且在加工前期半膜肌蛋白降解程度更高。Zhou Guanghong等[13]论述了在金华火腿的加工过程，10%的水不溶性蛋白被降解为水溶性蛋白，进而被降解为多肽和游离氨基酸，水溶性蛋白相对含量从腌制前的71.63%降低至后熟阶段的27.57%，且加工结束阶段分子质量小于1 kDa的肽和游离氨基酸占非蛋白氮的95%甚至更多。Xing Lujuan等[14]研究了金华火腿和宣威火腿的抗氧化多肽的含量和活性差异，结果表明分子质量小于1 000 Da的多肽具有较强的抗氧化活性，并对蛋白质组学同源性进行了分析，表明大部分多肽来源于肌球蛋白，分别占宣威火腿多肽的26%和金华火腿多肽的32%。综上所述，干腌火腿加工过程中，肌原纤维蛋白的降解是活性肽产生的重要来源，且蛋白质的降解伴随着腌制一直持续到发酵和后熟阶段。

1.2 肌肉中内源酶与活性肽形成机理的相关性

火腿加工过程中活性肽的形成与多种肌肉中内源酶相关，当前该领域内对组织蛋白酶尤其是组织蛋白酶B、D、H、L和钙蛋白酶以及外肽酶（包括三肽酶、二肽酶和氨肽酶）的研究较多。组织蛋白酶B、H和L在火腿加工过程中具有较好的稳定性，且经历15 个月的加工后仍保留5%～10%的活性，而组织蛋白酶D在加工6 个月左右活性消失[15]。钙蛋白酶可能在干腌火腿加工初期具有重要作用[16]，在加工后期活性很低甚至检测不到。对于中华传统金华火腿，赵改名[17]对肌肉蛋白水解酶在金华火腿加工过程中的作用进行了研究，研究结果表明在火腿加工阶段，组织蛋白酶B和L的活力均呈现下降趋势，加工结束时两种蛋白酶的活力分别降至腌制前的9.31%和13.66%。

钙蛋白酶是一组半胱氨酸类内肽酶，组织蛋白酶B、H和L都是巯基蛋白酶，组织蛋白酶D是一种天冬氨酸酶，它们对蛋白质的作用不同。Baron等[18]运用体外实验研究μ-钙蛋白酶、m-钙蛋白酶和组织蛋白酶对结蛋白的作用，发现钙蛋白酶首先酶解结蛋白形成多肽，随后组织蛋白酶继续降解形成小肽。组织蛋白酶B对肌动蛋白有显著降解作用，产生的大部分肽类是从蛋白质的N端和C端释放出来的，而且大多数为水溶性多肽，这些多肽可能对干腌肉制品的风味具有重要影响，在pH值为5.0时，组织蛋白酶B能够水解肌球蛋白、肌钙蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白；组织蛋白酶L能够降解肌球蛋白重链、α-肌动素、肌动蛋白、肌钙蛋白的T亚基和I亚基[17]。组织蛋白酶H几乎不能降解任何肌原纤维蛋白，它的活性在加工过程中缓慢下降[19]。组织蛋白酶D能广泛降解肌原纤维蛋白，但在加工过程中活性降低较快，推测其主要在加工前中期发挥作用。综上所述，火腿中各种活性肽的产生与酶关系紧密，但是具体功能活性肽的产生与特定酶的关系有待更加深入的研究。

2 干腌火腿中活性肽的功能特性

2.1 干腌火腿中活性肽的抗氧化性

生物体在新陈代谢中会产生高氧化活性的自由基，而自由基在细胞中的过度积累将会导致细胞损伤，并且在特定的代谢率下与机体寿命显著相关[20-21]，天然抗氧化剂可促进过氧化氢的分解，清除多余的重金属，从而降低自动氧化速率，减少过氧化氢的含量以及自由基的生成[22]，进而减轻氧化损伤。其中天然蛋白质经过降解产生低分子质量的肽，某些能降低自动氧化速率及脂肪的过氧化物含量，具备较高的抗氧化活性[23]。近30 年，来自干腌火腿中抗氧化肽的研究成果比较丰富，不同类别的干腌火腿抗氧化肽氨基酸序列和含量不同，且活性及稳定性也具有较大差异。

在国内传统干腌火腿中抗氧化肽的研究中，Zhu Chaozhi等[24-25]从金华火腿中分离提取到肽段，根据其羟自由基的清除活性、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除活性和Fe2+螯合能力来评价其抗氧化活性，发现金华火腿中肽具有抗氧化活性，并将活性最高的肽片段序列确定为GKFNV，但该活性肽在胰蛋白酶处理后或者在碱性环境下活性会受到影响。邢路娟等[26]研究宣威火腿中肽的抗氧化活性，结果表明相同质量浓度下，宣威火腿粗肽液对超氧阴离子自由基的清除率及对脂质氧化的抑制率均高于谷胱甘肽。Xing Lujuan等[27]在研究中对宣威火腿加工过程中产生的抗氧化肽进行结构鉴定，结果表明抗氧化活性最高的肽为四肽，其氨基酸序列为DLEE，且可能是抗氧化肽中起关键作用的主要肽段之一。云南诺邓火腿中的肽也具有一定的抗氧化活性，在模拟实验中对脂质氧化和蛋白质氧化均具有一定的抑制作用[28]。

在国外干腌火腿抗氧化肽的研究中，Escudero等[29-30]从西班牙干腌火腿提取并纯化得到抗氧化肽，通过鉴定，对DPPH自由基清除作用最强的肽序列为SAGNPN，其质量浓度为1.5 mg/mL时清除率达到50%，而还原能力最强的多肽序列为GLAGA。在Mora等[31]的研究中，通过凝胶排阻色谱法得到93 个肽段并对其进行抗氧化活性测定，发现序列为SNAAC的肽具有最高的DPPH清除能力和Fe2+螯合能力。

干腌火腿中肽的抗氧化活性以及活性强弱与其结构特征密切相关。一般来说，肽的抗氧化活性与其氨基酸序列相关，而且它们通常包含疏水性氨基酸残基，例如处于N端的缬氨酸和亮氨酸，以及序列中包含脯氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸的肽[32]。含有疏水性氨基酸的肽能够与氧结合或者减少体系中氢的释放来阻断氧化进程，进而发挥抗氧化功能。缬氨酸或亮氨酸等疏水氨基酸残基可以增加肽在脂质界面的含量，从而促进清除脂质阶段产生的自由基[33]。组氨酸具有活性侧链基团咪唑基，因此含组氨酸残基的肽抗氧化活性可能与其咪唑基团的供氢能力、脂质过氧自由基捕获或金属离子螯合能力相关[32]，Chen Huaming等[34]通过研究发现，抗氧化肽的金属离子亲和力与组氨酸含量呈正相关，且其亲和力与肽链末端位置的组氨酸残基有关。酪氨酸和色氨酸均是潜在的氢供体，氢原子能够与自由基结合，中断氧化反应链，有研究明确指出含有酪氨酸的二肽具有很强的自由基猝灭能力[35]。含硫氨基酸如半胱氨酸中的巯基可以将氢转移到高度氧化性的自由基中并使之还原，而在反应中生成的硫化物或二硫化物又可与氧气结合，预防组织内氧化应激的发生[36]。另外肽的抗氧化活性也与其分子质量相关。抗氧化肽一般由4～20 个氨基酸组成，分子质量在3 kDa以下[14]，大多数来源于食品中的抗氧化肽分子质量一般在500～1 800 Da[37]，Tang Xueyan等[38]将玉米蛋白水解物通过超滤分离，按照分子质量分成1、3、5、10 kDa的组分，并进行了自由基清除能力的测定，发现肽段的DPPH自由基清除能力和超氧阴离子清除能力均与分子质量相关，同时，在小于1 kDa的组分中，疏水性越高的肽段，抗氧化活性越高。

2.2 干腌火腿中活性肽的降血压活性

在人体中，肾素-血管紧张素系统在血压平衡中扮演着重要的角色，它与心血管疾病如充血性心力衰竭、高血压等密切相关，首先在肾素的催化作用下，血管紧张素原转化为血管紧张素（angiotensin，Ang）I，随后Ang I被血管紧张素I转化酶（angiotensin I converting enzyme，ACE）裂解，并释放Ang II，Ang II使血管收缩[39]。因此，抑制ACE的活性能够起到舒张血管、降血压的作用。干腌火腿中多肽的降血压活性研究较多，而且该活性机理目前已阐述清楚。

Sentandreu等[40]研究发现西班牙传统火腿经过二肽酶酶解产生的二肽具有ACE抑制活性，Escudero等[41]提取西班牙传统火腿中的降血压肽，研究证明了该活性肽的体内降血压活性，并且通过纯化和鉴定，发现序列为AAATP的肽段降血压活性最高。Mora等[42]研究比较了发酵期更长（发酵期24 个月）的伊比利亚火腿（Iberian dry-cured ham）同西班牙传统火腿（发酵期12 个月）降血压肽的活性差异，结果表明伊比利亚火腿中某些肽段的ACE抑制率达到了97.7%，具有比传统火腿更高的降血压活性。在中国传统干腌火腿中，左庆翔[43]研究发现金华火腿多肽具有较强的ACE抑制能力和肾素抑制能力，结构分析表明NLLPP、DEP和DAVLP可能是主要的降血压活性肽。

研究表明，ACE抑制肽活性与其氨基酸序列相关，一般ACE抑制肽在C末端的倒数第二个位置为精氨酸、脂肪族氨基酸（丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸）以及芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸），在肽段的最后一个位置为脂肪族氨基酸（异亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸）、芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）以及脯氨酸（脯氨酸）；另外在N末端也多为疏水性氨基酸。疏水性多肽因与Ang I结构相似，能够与ACE的活性位点结合[44]，使得ACE无法将Ang I转化为Ang II，进而发挥收缩血管的作用，达到降血压的目的。

2.3 干腌火腿中活性肽的抗菌性

抗菌肽是指有机体在真核生物的核糖体和原核生物非核糖体合成的小分子碱性多肽[45]。抗菌肽在动植物界广泛分布，在复杂多细胞生物的成功进化中发挥了重要作用，是抵抗细菌、真菌以及病毒非常重要的防御武器[46]。在天然抗菌肽的研究领域，多集中在昆虫、鱼类以及植物中，针对干腌火腿中多肽的抗菌活性研究较少。

邢路娟等[47]为探究干腌火腿中生物活性肽的抗菌活性及其组成，选取产自中国云南省曲靖地区的宣威火腿为材料，通过缓冲液浸提的方法提取火腿中的多肽成分，结果表明宣威火腿多肽具有显著抑制单增李斯特菌和O157型大肠杆菌生长的效果，通过进一步分离和鉴定，得到抑菌活性较强的3 段多肽：QYYNGEEHVRFDSDVGEYR、LRNLPNLEVLDLGTNFI、FASFEAQGALANI AVDK。郑晓锦等[48]提取宣威火腿、金华火腿、如皋火腿中粗多肽并比较3 种干腌火腿的抑菌活性差异，结果表明3 种火腿粗肽液均具能抑制大肠杆菌的生长，宣威火腿粗肽中具有较高的肽含量和较多的疏水性氨基酸，粗肽液具有更高的抑制大肠杆菌的能力。Castellano等[49]对西班牙干腌火腿的抗菌肽进行提取、抑菌活性测定以及纯化鉴定，结果表明10 种多肽均能抑制单增李斯特菌的生长，且氨基酸序列为RHGYM的肽抑菌活性最强，最小抑菌浓度为6.25 mol/L。

抗菌肽一般都有两亲性结构，即富含亲水性碱性氨基酸残基的N端，如赖氨酸和精氨酸，以及富含亲脂性疏水氨基酸的C端，且C末端均被酰胺化[50]。抗菌肽的结构特征使得抗菌过程的第一步能够顺利完成，即在静电相互作用下，侧链带正电荷的抗菌肽同带负电荷的细菌细胞膜相结合[51]；随后细胞膜上即时通道打开，抗菌肽进入细胞参与蛋白合成、DNA转录或者影响酶活性进而破坏细胞正常的代谢[52]。基于干腌火腿中具有抗菌活性的肽目前研究成果较少，推测可能的原因是干腌火腿的发酵和成熟过程需要多种微生物的参与，而微生物的代谢可能有助于蛋白质降解和多肽的形成，其中的作用机理尚不清楚。

2.4 干腌火腿中活性肽的其他功能特性

近年来，干腌火腿的其他生物活性也逐渐被研究学者发现，如降血糖、抗炎症等活性。糖尿病是由于胰岛素分泌不足和（或）胰岛素作用缺陷所致的一种以慢性高血糖为主要表现的临床综合征[53]。针对糖尿病的一些治疗靶点，领域内学者正在研发和实验各种药物，其中二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）是治疗2型糖尿病的新型靶点，它能够迅速灭活肠促胰岛素胰高血糖素样肽-I（glucagon-like peptide-I，GLP-I）和糖依赖性胰岛素释放肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）等多种激素，而DPP-IV抑制剂则能够提高内源性GLP-I和GIP的活性，促进胰岛素分泌，达到降低血糖的目的[54]。Gallego等[55]在传统干腌火腿中发现了对DPP-IV具有抑制作用的肽，经过鉴定，二肽KA和AAATP对DPP-IV的抑制活性最强，半抑制浓度分别为6.27 mmol/L和6.47 mmol/L。

具有抗炎作用的天然活性肽在植物、动物、真菌和海洋生物中广泛分布[56]，并且抗炎活性通常与降血压活性相关联。Gallego等[57]研究西班牙干腌火腿中肽的抗炎活性，结果表明氨基酸序列为PSNPP、HCNKKYRSEM和FNMPLTIRITPGSK的肽提取物显示出对血小板活化因子-乙酰水解酶（platelet activating factor-acetylhydrolase，PAF-AH）、自分泌运动因子（autotaxin，ATX）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的抑制作用。PAF-AH一直是许多炎症性疾病如哮喘、败血症和血管疾病临床研究的标志物，与正常人相比，疾病患者的血浆PAF-AH活性发生了改变[58]。ATX在调节免疫反应方面发挥重要作用[59]，如类风湿性关节炎。LOX是一种含铁的双加氧酶，该家族成员在生物体内专一催化含特定结构的多元不饱和脂肪酸如花生四烯酸和亚油酸生成相应活性脂质，并在炎症发生和消除中起到重要作用[60]。而活性肽可以通过调节PAF-AH、ATX和LOX的活性，进而减轻机体的炎症反应。我国对于干腌火腿活性肽功能特性的研究集中在抗氧化、降血压和抗菌作用，鲜有抗炎症和降血糖作用的报道。

3 结 语

综上所述，干腌火腿在加工过程中，肌肉中蛋白质发生分解，产生各类肽以及游离氨基酸，而其中的一部分多肽经国内外学者研究证明具有较高的生物活性，这些生物活性包括抗氧化、降血压和抗菌等，且在体外模拟实验中稳定性较高，为后续的体内实验及应用提供理论基础。肽的抗氧化活性主要与氨基酸序列中疏水性氨基酸相关，如缬氨酸和亮氨酸，一般疏水性越高，抗氧化活性也越高，而部分疏水性肽因其与Ang I结构相似，能够作为ACE的作用底物，通过竞争抑制发挥降血压作用。具有抗菌活性的肽一般由亲脂性疏水氨基酸C端和亲水碱性氨基酸N端组成，这样的结构使抗菌肽能够顺利通过细菌细胞膜进而进入细胞。通过对生物活性肽的分离纯化和鉴定，发现肌肉蛋白质中的肌原纤维蛋白是活性肽的主要来源，在加工过程中，钙蛋白酶、组织蛋白酶B、D、L和H是催化蛋白质降解产生活性多肽的主要酶类。

经过多年发展，利用蛋白质组学方法进行样品预处理、蛋白质定性定量分析以及结合生物信息学方法进行蛋白质组分析、数据解析等新技术为天然生物活性肽的研究提供了便利和新的方向。比如蛋白质组学分析技术在特定功能的活性肽研究中发挥重要作用，推动生物活性肽的市场化应用；利用生物信息学方法可以对各类干腌火腿中多种活性肽的蛋白质同源性进行分析，为天然生物活性肽的深入研究提供技术支撑；数据解析等多种新技术的综合应用将有助于揭示火腿蛋白质降解机理，为干腌火腿的品质提升提供理论指导。目前，针对干腌火腿中多肽的来源、功能活性以及结构鉴定研究较为成熟，在活性肽的形成机理方面，主要集中在内源酶的研究方向，针对外源微生物与多肽形成的关系尚未阐明。另外，基于提升干腌火腿营养价值，着眼于低盐的健康饮食理念，阐明低盐环境对于活性肽含量及其功能特性的影响和实现活性肽的富集工艺等相关研究也鲜有报道，有待于进一步探索。