GnRH拮抗剂联合来曲唑和米非司酮对体外培养的人颗粒细胞功能的影响

周小丹，梅忆媛，漆倩荣，钟方圆，谢青贞

(武汉大学人民医院生殖医学中心 湖北省辅助生殖与胚胎发育医学临床研究中心，武汉 430060)

卵巢过度刺激综合征(OHSS)是使用促排卵药物后发生的医源性并发症，其主要特征为卵巢增大、毛细血管通透性增加、胸腹腔积水，严重时可能危及患者生命。目前，卵巢高反应患者中、重度OHSS的发生率高达20%[1]。因此，如何有效防治OHSS的发生是临床密切关注的问题。根据OHSS发生时间分为早发型和迟发型[2]，早发型OHSS病程短、症状轻，多在月经来潮前消退；而迟发型OHSS多在妊娠后发生，往往病程长、症状重，催经、促黄体溶解作用可能防治OHSS发生。有研究表明，OHSS高危患者黄体期单独应用促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH-ant)、来曲唑或米非司酮治疗后，中重度OHSS发生率(18.03%、25.0%、2.33%)分别低于对照组(37.14%、45.1%、12.77%)，其作用机制可能是通过促进黄体溶解、降低血管内皮生长因子(VEGF)水平[3-5]。但也有研究认为，GnRH-ant、来曲唑及米非司酮并不能有效降低临床OHSS发生率[6]。黄素化颗粒细胞是构成黄体的主要类固醇激素分泌细胞，其产生的VEGF被公认为OHSS发生的关键因子[7]。因此，本研究选择通过体外分离获得的人原代卵巢颗粒细胞(Human granulosa cells，hGCs)及人卵巢颗粒细胞系KGN，探讨GnRH-ant、来曲唑、米非司酮及三组药物联合应用对颗粒细胞功能及VEGF表达的影响，旨在为临床OHSS的防治提供理论依据。

材料和方法

一、实验材料

人卵巢颗粒细胞系KGN购自ATCC细胞典藏中心。实验所用的人原代卵巢颗粒细胞来源于2018年3～10月在武汉大学人民医院生殖中心行IVF-ET治疗的不孕患者的卵泡液。患者的纳入标准：年龄21～35岁，因输卵管炎或男方因素导致不孕。

本实验获得武汉大学人民医院伦理委员会批准。所有患者均签署知情同意书。

二、实验方法

1.人原代颗粒细胞分离培养及分组：采用Percoll梯度离心法提纯获取人原代颗粒细胞，具体方法见文献[8]。根据预实验结果确定所选药物的干预浓度，利用GnRH-ant(思则凯，默克雪兰诺，瑞士)、来曲唑(Letrozole，大连美仑生物)、米非司酮(大连美仑生物)及联合用药分别处理细胞：原代颗粒细胞及KGN细胞体外培养24 h后分别加入10 nmol/L GnRH-ant、10 μmol/L来曲唑、1 μmol/L米非司酮及联合用药(10 nmol/L GnRH-ant+10 μmol/L来曲唑+1 μmol/L米非司酮)干预24 h；并设立空白对照组。

2.细胞活力检测：将原代颗粒细胞、KGN细胞分别按1×105/孔、3×103/孔密度接种于96孔板，每组均设3个复孔，药物处理同前。干预24 h后每孔加入10 μl CCK-8液(同仁化学，日本)，孵育2 h后，置酶标仪上于450 nm波长处测OD值，对照调零后取各组复孔均值。

3.细胞凋亡检测：原代颗粒细胞及KGN细胞分别按2×106/ml、2×105/ml密度接种于6 cm培养皿内，分组及药物处理同前。消化、重悬细胞后，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒(BD，美国)操作说明在各组500 μl细胞悬液中分别加入5 μl Annexin V-FITC与PI避光孵育30 min，流式上机检测。

4.细胞分泌水平检测：收集不同药物干预细胞24 h后的上清液，1 000 rpm离心5 min，吸取上清，根据ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特)操作说明书对各组E2、孕酮(P)、VEGF分泌水平进行检测。

5.细胞VEGF基因表达水平检测：采用实时荧光定量PCR反应。按标准操作流程提取颗粒细胞总RNA，日本Takara试剂盒进行RNA逆转录获得cDNA。根据试剂盒说明书冰上配制反应体系，RT-PCR仪检测。引物购于上海生工生物公司，序列如表1所示。最终实验结果以2-△△Ct法对基因表达的相对水平进行计算。

表1 PCR引物序列

三、统计学分析

结 果

一、各组药物干预对细胞活力的影响

与对照组比较，GnRH-ant、来曲唑、米非司酮及联合用药均显著抑制原代颗粒细胞(hGCs)及KGN细胞的活力(P<0.05)。其中原代颗粒细胞实验发现，米非司酮组的细胞活力显著低于GnRH-ant组，联合用药组的细胞活力显著低于其他单一用药组(P<0.05)。KGN细胞实验中，联合用药组的细胞活力显著低于GnRH-ant和来曲唑组(P<0.05)(图1)。

二、各组药物干预对细胞凋亡的影响

与对照组相比，GnRH-ant、来曲唑、米非司酮及联合用药组均促进颗粒细胞(hGCs)及KGN细胞凋亡，其中米非司酮组及联合用药组差异具有统计学意义(P<0.05)。KGN细胞实验中，米非司酮组细胞凋亡率高于GnRH-ant、来曲唑组(P<0.05)，联合用药组细胞凋亡率最高且差异具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

与对照组比较，*P<0.05；与GnRH-ant组比较，#P<0.05；与来曲唑组比较，&P<0.05；与米非司酮组比较，￥P<0.05图1 不同药物干预对细胞活力的影响

与对照组比较，*P<0.05；与GnRH-ant组比较，#P<0.05；与来曲唑组比较，&P<0.05；与米非司酮组比较，￥P<0.05图2 不同药物干预对细胞凋亡的影响

三、各组药物干预对细胞E2、P分泌水平的影响

原代颗粒细胞(hGCs)实验中，GnRH-ant、来曲唑及联合用药组上清液E2水平均显著低于对照组(P<0.05)，联合用药组均低于单一用药组(P<0.05)；KGN细胞实验中，来曲唑和联合用药组上清液E2水平显著低于对照组(P<0.05)。原代颗粒细胞(hGCs)实验中，来曲唑、米非司酮及联合用药组上清液P水平显著低于对照组(P<0.05)，其中联合用药组低于GnRH-ant和来曲唑组(P<0.05)。KGN细胞实验中，联合用药组上清液P水平显著低于对照组(P<0.05)(图3)。

与对照组比较，*P<0.05；与GnRH-ant组比较，#P<0.05；与来曲唑组比较，&P<0.05；与米非司酮组比较，￥P<0.05图3 不同药物干预对细胞E2、P分泌水平的影响

四、各组药物干预对细胞VEGF表达水平的影响

原代颗粒细胞实验中，GnRH-ant、来曲唑及联合用药组VEGF mRNA水平均显著低于对照组(P<0.05)；GnRH-ant、来曲唑、米非司酮及联合用药组VEGF分泌水平均显著低于对照组(P<0.05)，其中联合用药组VEGF分泌水平还显著低于GnRH-ant和米非司酮组(P<0.05)。KGN细胞实验中，GnRH-ant及联合用药组VEGF mRNA水平显著低于对照组(P<0.05)，联合用药组VEGF分泌水平显著低于对照组(P<0.05)。

与对照组比较，*P<0.05；与GnRH-ant组比较，#P<0.05；与来曲唑组比较，&P<0.05；与米非司酮组比较，￥P<0.05图4 不同药物干预对细胞VEGF表达水平的影响

讨 论

OHSS是不孕患者使用促排卵药物后发生的医源性并发症，严重者可危害患者生命。目前OHSS发生机制尚未完全阐明，研究认为可能与HCG反应下多个黄体释放大量血管活性物质如VEGF、卵巢肾素-血管紧张素和其他细胞因子有关[1，7]。本课题组的临床研究显示，OHSS高危患者黄体期早期联合使用GnRH-ant、来曲唑和米非司酮可较单一用药更能有效缩短黄体期天数、降低OHSS发生，原因可能与三种药物协同作用降低雌孕激素水平、加速黄体溶解有关[9]，但具体机制尚未明确。黄体主要由排卵后卵巢黄素化颗粒细胞构成，可以分泌类固醇激素及其他细胞因子；促进黄体细胞凋亡、抑制类固醇激素分泌，可以导致黄体功能性和结构性退化，提前出现黄体溶解[10-11]。本研究实验结果显示GnRH-ant、来曲唑、米非司酮分别抑制原代颗粒细胞及KGN细胞活力，降低颗粒细胞E2、孕激素分泌水平，但联合用药组作用最为显著。

GnRH-ant通过与垂体GnRH受体竞争性结合，可直接使黄体失去Gn支持，从而影响黄体活性和激素水平[12-13]。临床研究表明，GnRH-ant可能直接作用于卵巢促进黄体溶解，导致VEGF、雌激素水平降低，OHSS症状快速消退[14]。本研究实验结果显示，GnRH-ant可显著抑制颗粒细胞活力、降低E2分泌水平，但对细胞凋亡率及孕激素分泌水平并无明显影响。研究表明，GnRH-ant西曲瑞克可以降低人颗粒细胞生存活性，但对类固醇激素生成作用较小并呈剂量依赖性；GnRH-ant可能是通过与颗粒细胞中GnRH受体结合后激活Gi蛋白，从而诱导细胞凋亡、降低细胞活力[13]。OHSS患者体内血清E2水平常高于非OHSS患者，临床上常将其作为预测OHSS发生的重要指标之一。

来曲唑(Letrozole)是一种芳香化酶抑制剂，可以降低颗粒细胞P450芳香酶mRNA表达和E2分泌水平[15]。本文研究显示，来曲唑抑制原代颗粒细胞及KGN细胞活力、降低E2分泌水平。研究表明，雌激素可促进颗粒细胞增殖，抑制颗粒细胞凋亡[16]。来曲唑可能通过降低雌激素分泌水平进而影响颗粒细胞活力，但本研究中来曲唑组的颗粒细胞凋亡率与对照组相比并无显著差异。此外，本研究发现，来曲唑可以抑制原代颗粒细胞分泌孕激素水平及VEGF表达。研究显示，VEGF可促进黄体形成及孕激素分泌，当VEGF作用受到阻断时孕激素水平降低并影响黄体的形成[17]。

孕激素具有保护黄体细胞活性的作用，米非司酮作为孕激素拮抗剂，通过调节颗粒细胞内孕激素受体表达及活性，降低孕激素生成，从而促进黄体颗粒细胞凋亡及黄体退化[18]。本研究中米非司酮可显著抑制颗粒细胞活性，促进细胞凋亡，降低孕激素分泌水平。且相关研究表明，米非司酮作用24 h后，颗粒细胞可出现凋亡形态学改变，并可通过激活细胞凋亡因子caspase-3活性导致颗粒细胞凋亡[19]。

本研究发现虽然GnRH-ant、来曲唑、米非司酮可能通过不同作用机制不同程度降低颗粒细胞活性、抑制细胞类固醇激素分泌功能促进黄体结构性和功能性退化，但联合用药组较单一用药作用更为显著。

VEGF是一种糖蛋白结构的生长因子，具有促进血管生成及内皮细胞增殖的特性，对卵巢血管及促黄体血管生成具有重要作用[10]。目前，VEGF常被作为检测各种药物及方案防治OHSS效果的主要指标。本研究发现，GnRH-ant、来曲唑均可抑制原代颗粒细胞VEGF mRNA表达及VEGF分泌水平。研究发现，GnRH-ant在体外显著降低人颗粒细胞VEGF的分泌，相反GnRH激动剂并不能显著降低VEGF水平，可能与GnRH-ant直接作用于卵巢GnRH受体激活G蛋白途径有关[20]。临床研究显示黄体期应用来曲唑可显著降低VEGF水平且呈剂量依赖性降低[21]；另有研究表明来曲唑可显著降低高危OHSS患者中重度OHSS的发生率，原因主要是通过促进黄体溶解而并不降低血清VEGF的水平[3]，可能与患者体内各种激素水平相互作用有关。此外，有研究认为，雌激素可能间接作用促进黄体细胞VEGF分泌且芳香化酶抑制剂作用后VEGF水平的降低[22]。本研究发现，与GnRH-ant、来曲唑不同，米非司酮可显著降低原代颗粒细胞VEGF分泌水平，但VEGF mRNA水平与对照组相比并无显著差异。动物研究表明，随着米非司酮剂量的增加，卵巢VEGF分泌水平呈剂量依赖性降低，但VEGF mRNA表达水平并无显著改变[23]。促排卵患者卵泡内VEGF水平与血清、卵泡内孕激素水平呈正相关比例关系[24]，米非司酮降低孕激素水平、抑制VEGF生成，但它们之间的相互作用机制仍需进一步研究。结合原代颗粒细胞及KGN细胞实验结果发现，虽然GnRH-ant、来曲唑及米非司酮不同程度上降低颗粒细胞VEGF表达水平，但联合用药组VEGF mRNA表达及分泌水平最低，且与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，本研究通过人原代颗粒细胞及KGN细胞系发现GnRH-ant抑制VEGF表达、来曲唑抑制雌激素分泌、米非司酮促进细胞凋亡并降低孕激素产生，但三组药物联合较单一用药显著抑制颗粒细胞活力，促进细胞凋亡，降低细胞E2及孕激素分泌水平，抑制细胞VEGF表达，为临床防治OHSS提供了更多理论依据。