探讨防风通圣散对多囊卵巢综合征大鼠血清激素及卵巢组织学影响

林青 李以良 王梦雨

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种发病多因、临床表现多态的综合征，是以卵巢多囊性改变、高雄激素血症和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)/促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)比值增高[1]为主要临床表现的生殖内分泌紊乱性疾病[2]。育龄期妇女患病率达到 5%～8%[3]。PCOS的临床表现具有异质性，其病理生理也较为复杂，除对生活质量产生不利影响外，还易出现不孕症、高胰岛素血症及心血管疾病等并发症[4]。根据其症状，中医学可归于“月经后期” “崩漏” “闭经” “不孕”等病证范畴。多囊卵巢综合征病因病机为肾、肝、脾 三脏功能失调，受痰湿、瘀血等病理产物侵袭，两者互为因果作用于机体，使肾—天癸—冲任—胞宫轴功能紊乱而致。证属本虚标实、虚实夹杂。针对于多数PCOS患者月经稀发或闭经、肥胖、痤疮等症状，部分现代学者提出，防风通圣散或可以应用于此病的临床治疗中。

有研究人员[5]将PCOS按体质分有防风通圣散体质和五积散体质，其中大多属防风通圣散体质。其典型体质表现为：体格壮实或肥胖，面色红多油腻，皮肤干燥、粗糙，好发痤疮，食欲好，便秘，唇红或黯红，月经偏少，甚至闭经。并通过临床实践表明，防风通圣散对实热型肥胖体质患者，可改善高雄激素、高LH及高胰岛血症或胰岛素抵抗的内分泌状态，以达到促进排卵的作用。有学者提出[6]治疗痰湿闭经应主要从减肥、通经、调周期方面入手，认为痰浊脂肪蕴塞，大便秘结之肥胖，当给予防风通圣丸治疗，以达到表里双解、通腑泄热的目的。日本学者原桃介[7]应用防风通圣散治疗肥胖症患者，平均体重减轻10%，认为其具有加速新陈代谢产物排泄，提高脂肪代谢的功效,并推断该方减肥机制可能在于分解脂肪,但其对蛋白质代谢的影响不明显。李联甫[8]报道有学者以防风通圣散及防己黄芪汤治疗本病，经治后体重减轻，胆固醇、甘油三酯下降明显，研究指出防风通圣散适用于结实型肥胖。日本学者宫本尚[9]于两餐间和间歇给药,并用防己黄芪汤及防风通圣散治疗肥胖症患者6个月，病人平均体重指数明显下降，食欲下降，说明该方对肥胖患者有疗效显著。防风通圣散老药新用，为临床PCOS的治疗提供了一种可能性。

本研究改良了防风通圣散的药物剂量配比，通过建立PCOS大鼠模型，研究改良后的防风通圣散对大鼠血清LH、FSH、血清睾酮(testone，T)的影响以及其对卵巢组织形态学的影响，探讨本方改善PCOS患者性激素和排卵状况的作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性SD大鼠21日龄36只，体重200～280 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2016-0011。

1.2 药品与试剂

防风通圣散由防风、川芎、当归、芍药、麻黄、连翘、芒硝、生甘草、薄荷叶各10 g，滑石30 g，黄芩、桔梗、石膏各15g，大黄、荆芥、白术、栀子各3 g17味中药组成，由北京中医药大学东方医院配方颗粒室按工艺流程煎制配成颗粒(单号：01169)，将配方颗粒融于80℃水中，含生药量为1.8 g/mL，4℃保存备用。注射用人绒毛膜促性腺激素：北京中医药大学东方医院药剂科。丙酸睾酮：MCE生命科学试剂服务商，批号：HY-B1269。血清LH、FSH、T试剂盒：天津协和医药科技集团有限公司，批号分别为：RA10201、RA10202、RA10206。HE染色试剂盒：Solarbio，批号：G1120。1%羧甲基纤维素钠溶液：Coolaber，批号：C9230。

1.3 模型制备与分组

目前，国内外建立PCOS大鼠模型方法主要有以下几种：雄激素联合胰岛素造模法、胰岛素联合HCG造模法、芳香花酶抑制剂造模法、雄激素造模法、胰岛素类造模法、孕激素联合HCG造模法、雄激素联合HCG造模法等[10]。本实验采用 Beloosesky造模法[11],即大鼠背部皮下注射丙酸睾酮及人绒毛膜促性腺激素。将21日龄的雌性SD大鼠36只，适应性常规饲养(室温保持在20℃左右，湿度 65±5%，食物饮水充足，环境安静) 3天后，将大鼠分为空白组12只和PCOS组24只，PCOS组24只于23日龄起颈背部皮下注射丙酸睾酮(1.25 mg/只，一日1次)及绒促性腺素(1.5 IU/只，早晚各一次)，持续 5 周。空白组12只每日皮下注射橄榄油(0.05 mL/只，一日1次)及生理盐水(0.1 mL/只，早晚各1次)，持续5周。

造模最后10日，大鼠阴道脱落细胞学检查，模型组均失去完整动情周期。空白组随机取2只、PCOS组随机取4只进行腹主动脉采血，离心取血清，用睾酮放免试剂盒检测T，PCOS组较正常组明显升高。揭示造模成功。

1.4 给药方法

随机将造模成功的20只大鼠分为：模型组10只，中药组10只；并将空白组10只另成1组，共分为3组。空白组等体积 0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，模型组等体积 0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃，中药组：按18 g/(kg·d)给药，约等于成人每公斤体重用药量6倍。三组灌胃均1次/天，连续21天。灌胃治疗期间，各组大鼠均正常饲养，每周称重一次。

1.5 检测项目及方法

造模最后一天禁食过夜。各组大鼠于最后一次灌胃后第2天以10%的水合氯醛(0.33 mL/100 g)麻醉。

(1)血清激素水平测定：麻醉后，腹主动脉取血后采血5 mL，按 1.2×106rpm/分钟速度下离心30分钟，吸取上清液，分装置于-20℃冰箱中备用。用放射免疫法检测血清T、LH、FSH水平，并计算LH/FSH比值。

(2)卵巢形态学观察：根据阴道涂片结果，动情间期内大鼠麻醉后，腹主动脉取血后大鼠断颈处死，卵巢组织用4%多聚甲醛固定，各级酒精脱水，石蜡包埋，卵巢切片(每张切片厚约5 μM)，HE 染色，在光镜下观察比较各组间卵巢形态学(颗粒细胞、卵泡和黄体)变化。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠FSH、LH、T、LH/FSH水平比较

药物处理第22天，中药组LH水平、LH/FSH水平、T水平经分析均低于模型组(P<0.05)，中药组FSH水平较模型组无明显差异；中药组T水平低于空白组(P<0.05)，中药组FSH水平、LH、LH/FSH水平、T水平较空白组无明显差异；空白组LH水平、LH/FSH水平、T水平均低于模型组(P<0.05)，空白组FSH水平较模型组无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠FSH、LH、T及LH/FSH水平比较

2.2 各组大鼠卵巢组织形态学比较

空白组卵巢色鲜红，体积较小，组织表面相对光滑。模型组卵巢表面颜色较空白组而言相对苍白，体积偏大。中药组卵巢颜色较空白组而言略苍白，但较模型组而言则相对红润，体积与模型组相近。

光镜下空白组见黄体和处于不同发育阶段的多个卵泡，卵泡颗粒细胞为9～16层，排列整齐，卵泡内可见放射冠以及卵母细胞(见图1A、B)；模型组见黄体和多个囊性扩张的卵泡，卵泡体积增大，呈串状，卵泡中放射冠或卵母细胞消失，颗粒细胞为2～4层，排列疏松(见图1C、D)；中药组黄体及处于不同发育阶段的卵泡数量介于对照组和模型组之间，部分卵泡内可见放射冠以及卵母细胞，颗粒细胞层为8～10层，排列紧密(见图1E、F)。

3 讨论

中医方面，PCOS并无对应的病名，多归为“无子” “闭经”等疾病范畴。傅山《女科仙方·卷二》曰：“且肥胖之妇，内肉必满，遮子宫，不能受精。”朱丹溪在《丹溪心法》中曰：“若是肥盛妇人，享受其厚，态于酒食之人，经水不调，不能成胎，谓之躯脂满溢，闭塞子宫，宜行湿燥痰”，以及“痰积久聚多，随脾胃之气以四溢，则流溢于胃肠之外，躯壳之中，经络为之奎塞，皮肉为之麻木，甚至结成窠囊，牢不可破，其患因不一矣”。丹溪文中提出的“痰夹於血，逆成窠囊”之“窠囊”即似多囊卵巢之改变。现代中医学者对于多囊卵巢综合征的病因病机尚未形成统一的定论。国医大师柴嵩岩教授认为，本病病机以脾肾不足、湿浊结聚(胞络)为主[12]。

注：A.空白组(×100)；B.空白组(×400)；C.模型组(×100)；D.模型组(×400)；E.中药组(×100)；F.中药组(×400)。

防风通圣散出自于《黄帝素问宣明论方》卷三，由防风、大黄、白术、竹茹、茯苓、川芎、当归、麻黄、黄芩、栀子、白芍等17味中药组成，是解表、清热、攻下三者并用之方，宣通气血、上下分消、表里交治，于散泻之中，寓温养之意，其汗不伤表，下不伤里；主治外感风邪，内有蕴热，表里皆实之证。

3.1 糖脂代谢方面

现代药理学证实，防风通圣散对于体脂、血糖有显著的调节作用[13]，已经在治疗肥胖症方面得到广泛应用[14]，同时治疗面部痤疮[15]等疾病同样有显著疗效。PCOS患者,超过50%伴有肥胖或超重[16]，存在糖代谢和脂代谢的异常。中医学认为，脾胃功能运化失调是肥胖的病理基础。肥胖症多于外感湿邪，内蕴于脾；或恣食肥甘，伤及脾土，水湿内停，湿聚生痰，痰浊内停，久而化热有关。防风通圣散降低体脂、调节血糖，在治疗肥胖、痤疮等疾病的临床和实验成功案例为治疗PCOS提出了一个新的思路。此方配以化痰和血诸药加强健脾利湿，祛痰化瘀之功，协同治疗伴有代谢综合征肥胖型PCOS患者，为老药新用，疗效显著。

3.2 肠道代谢方面

PCOS的发病，目前的西医研究可大致分为以下几类：易感基因、炎症因子、转录因子κB、环境因素、氧化应激等[17]。近年来，越来越多的研究人员将研究重点放在了肠道菌群上，大量研究证实，肠道菌群严重影响了PCOS的发生和发展[18]。而这，与部分中医医家治疗妇人月经病的 “二阳致病”理论[19]不谋而合。具体来讲，二阳指的是手阳明大肠经和足阳明胃经，手阳明大肠经与肺经相表里，为传导之官化物出焉，同时又可通调腹部气机，若传导不畅,腹气不通，浊热积聚而便秘，阳明腑实，大便秘结，腹气不通，亦致胃不受纳，二阳积热进一步加深而成恶性循环，最终影响气血的化生，致冲任的失养，进而引发月经的失调。有研究证实，防风通圣散在治疗便秘方面也取得了显著的疗效[20]。虽PCOS患者合并表证比例不高[21]，但其治疗过程中需同时配以解表走上药物，以奏“提壶揭盖”之功。此方开玄府，利水道，在攻下清热的同时，上下分消，汗不伤表，下不伤里，正对应于PCOS本虚标实的病理特征。在PCOS患者中应用防风通圣散，就是取其通腑泄热之功。

3.3 实验结论

本研究结果显示，给予PCOS大鼠中药处理第22天，中药组LH水平、LH/FSH水平、T水平低于PCOS模型组(P<0.05),中药组T水平低于空白组(P<0.05)，中药组FSH水平、LH水平、LH/FSH水平与空白组差异无统计学意义。与PCOS模型组比较，中药组大鼠发育中卵泡和黄体数量略有增加，囊性扩张卵泡明显减少，颗粒细胞层增厚，排列较紧密。这说明防风通圣散可明显降低PCOS大鼠的T水平，对改善PCOS大鼠LH水平、FSH水平以及LH/FSH水平有明显的影响，并可有效改善PCOS大鼠的卵巢卵泡生长状态，这在一定程度上证明了防风通圣散对于PCOS大鼠有治疗效果。结合防风通圣散治疗糖脂代谢异常、肥胖症、便秘、痤疮等病证的突出疗效，其治疗肥胖型PCOS患者可有殊途同归之妙。但本研究中药组大鼠仅使用中药灌胃治疗，未设立采用其他方式治疗的对照组，仅讨论了防风通圣散对PCOS大鼠血清及卵巢组织中产生的变化，未深入研究其变化机制，同时尚缺少临床相关研究。因此，防风通圣散在PCOS治疗中的作用及机制需进一步研究证实，可能与调节糖脂代谢和调节肠道菌群有关。