肾气丸对膝骨性关节炎模型大鼠炎症因子和软骨基质的影响

李梓灏， 黄刚， 严伟健， 胡赢， 谢家豪

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510006；2.南方医科大学中西医结合医院，广东广州 510000）

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以膝关节软骨基质降解、软骨退变、滑膜无菌性炎症以及继发骨赘形成为主要特征的慢性退行性病变[1]，主要表现为膝关节疼痛、肿胀畸形、活动受限，是中老年人群除心脑血管疾病以外致残的最主要原因[2]。调查显示，我国中老年人群KOA的发病率为12%～15%，女性高于男性[3]。随着我国步入老龄化社会，KOA 的发病率和致残率呈现直线上升的趋势，不仅影响患者的生活质量，也对家庭和社会造成严重的负担。研究发现，肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素9（IL-9）、基质金属蛋白酶3（MMP-3）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、Ⅱ型胶原、雌二醇（E2）在KOA 的发生、发展中起到至关重要的作用[4-7]。中医学认为KOA 的核心病机是肝肾亏虚。肾气丸出自《金匮要略》，具有补益肝肾的功效，本团队临床应用肾气丸治疗KOA 患者，发现其可降低患者血清炎症因子水平，改善膝关节功能，缓解膝关节疼痛，增加膝关节活动度，提高生活质量，但其具体机制尚不明确。因此，本研究建立了KOA 大鼠模型，观察肾气丸对KOA 大鼠膝关节宽度、膝关节被动活动度、滑膜厚度、压痛阈值、热痛阈值和关节软骨中的TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9、Ⅱ型胶原、E2 的影响，以期阐明肾气丸防治KOA 的作用和机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物清洁级健康SD 大鼠40 只，体质量（210±10）g，由广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（粤）2018-0002。本实验于广东省中医院中医药科学院动物实验中心进行，饲养环境：温度20 ～25 ℃，湿度40%～60%，光照周期12 h/12 h。

1.2试剂与仪器木瓜蛋白酶（上海源叶生物科技有效公司）；TNF-α 酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（美国GeneTex 公司）；IL-1β、IL-9 ELISA试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司）；MMP-3、MMP-9 ELISA 试剂盒（美国ScienCell 研究实验室）；Ⅱ型胶原ELISA 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；E2 ELISA 试剂盒（上海歌凡生物科技有限公司）。爪触觉测试仪（意大利Ugo Basile 公司）；YLS-3E 型电子压痛仪（上海软隆科技发展有限公司）；BW-Plantar390 足底热测痛仪（上海软隆科技发展有限公司）；Multiskan Sky 全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；关节测量尺、游标尺（上海益联医学仪器发展有限公司）；ESJ30-5A/B 电子天平（沈阳神宇龙腾天平有限公司）。

1. 3肾气丸组成及制备肾气丸由熟地黄15 g、山药30 g、山茱萸15 g、泽泻10 g、茯苓10 g、牡丹皮10 g、桂枝10 g、熟附子10 g组成。上述中药饮片由广州中医药大学第二附属医院中药房提供，加4 倍量的水分别煎煮2 次，滤渣取液，2 次药液混合后浓缩至含生药0.23 g·mL-1，于4 ℃冰箱保存备用。

1.4动物分组、造模和给药40只大鼠适应性喂养1周后，按照随机数表随机分为正常组（10只）和造模组（30 只）。造模组大鼠参照Panicker 等[8]的方法建立KOA 模型：将大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，固定于手术台上，双膝关节腔内注射40 g/L木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，每2 d 1 次，共注射2 周。正常组大鼠仅对膝关节腔注射生理盐水。造模期间均自由饮食和饮水。2周后，进行膝关节X线片检查，若X 线片可见膝关节胫骨平台骨面欠光滑、不平整，且关节间隙狭窄，则提示造模成功。结果显示造模组36 只大鼠造模成功。随后将造模成功的大鼠随机分为模型组（9 只）、中药组（9只）、西药组（9只）。参照剂量-体表面积换算方法，中药组给予肾气丸11.55 g·kg-1·d-1灌胃，分2 次进行，西药组给予氨基葡萄糖生理盐水溶液157.5 g·kg-1·d-1灌胃，分2 次进行，正常组和模型组给予等体积（3 mL）的生理盐水灌胃，灌胃时间为8周。

1.5观察指标与方法

1.5.1 测量膝关节厚度、被动活动度 末次给药禁食禁饮12 h 后，用游标尺测量大鼠膝关节宽度，用关节测量尺测量膝关节的最大屈曲角度和最大伸直角度，计算被动关节活动度，被动关节活动度=最大屈曲角度-最大伸直角度。

1.5.2 测量膝关节滑膜厚度 麻醉处死大鼠后，打开膝关节腔取关节滑膜组织，用螺旋测微器测量膝关节滑膜厚度。

1.5.3 测定压痛阈值、热痛阈值 将大鼠固定于手术台上，压痛仪的扁形头压大鼠的患侧足背，当大鼠挣扎时即为压痛阈值。将热痛仪置于大鼠的足底中央，打开计时器计时，当大鼠挣扎抬腿时所用的时间即为热痛阈值。

1. 5. 4 检测关节液中TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9、Ⅱ型胶原、E2水平 常规消毒膝关节后，用5 mL 注射液抽取1.5 mL 生理盐水注射进大鼠的膝关节腔，反复活动膝关节20 次，缓慢抽取膝关节液，离心后取上清液，于-20 ℃保存备用。按照说明书采用ELISA 法检测关节液TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9、Ⅱ型胶原、E2的含量。

1.6统计方法采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1正常组和造模组大鼠膝关节X线检查结果比较图1结果显示：正常组膝关节关节软骨厚度正常，关节间隙无狭窄；模型组膝关节间隙明显变窄，关节软骨变薄，轻度骨刺，关节面硬化。提示造模成功。

图1 正常组和KOA造模组大鼠膝关节X线检查结果比较Figure 1 Comparison of X-ray examination results in the control group and KOA modeling group

2.2各组大鼠膝关节厚度、关节被动活动度、滑膜厚度的比较表1结果显示：与正常组比较，模型组大鼠的膝关节厚度、滑膜厚度显著增加（P<0.05），关节被动活动度显著减小（P<0.05）；与模型组比较，中药组、西药组大鼠的膝关节厚度、滑膜厚度均显著减小（P<0.05），关节被动活动度均显著增加（P< 0.05），且2 个治疗组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠膝关节厚度、关节被动活动度、滑膜厚度的比较Table 1 Comparison of the knee joint space width，passive knee joint range of motion，thickness of synovial membrane in various groups （±s）

表1 各组大鼠膝关节厚度、关节被动活动度、滑膜厚度的比较Table 1 Comparison of the knee joint space width，passive knee joint range of motion，thickness of synovial membrane in various groups （±s）

①P<0.05，与正常组比较；②P<0.05，与模型组比较

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2.3各组大鼠压痛阈值、热痛阈值的比较表2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠的压痛阈值、热痛阈值降低（P<0.05）；与模型组比较，中药组、西药组大鼠的压痛阈值、热痛阈值显著升高（P<0.05），且2 个治疗组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4各组大鼠关节液TNF-α、IL-1β、IL-9含量的比较表3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠的关节液TNF-α、IL-1β、IL-9 含量显著升高（P<0.05）；与模型组比较，中药组、西药组大鼠的关节液TNF-α、IL-1β、IL-9含量显著降低（P<0.05），且2 个治疗组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组大鼠压痛阈值、热痛阈值的比较Table 2 Comparison of the tenderness threshold and thermal pain threshold in various groups （±s）

表2 各组大鼠压痛阈值、热痛阈值的比较Table 2 Comparison of the tenderness threshold and thermal pain threshold in various groups （±s）

①P<0.05，与正常组比较；②P<0.05，与模型组比较

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表3 各组大鼠关节液TNF-α、IL-1β、IL-9含量比较Table 3 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-9 in synovial fluid of various groups （±s，pg·mL-1）

表3 各组大鼠关节液TNF-α、IL-1β、IL-9含量比较Table 3 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-9 in synovial fluid of various groups （±s，pg·mL-1）

①P<0.05，与正常组比较；②P<0.05，与模型组比较

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2.5各组大鼠关节液MMP-3、MMP-9、Ⅱ型胶原、E2含量的比较表4 结果显示：与正常组比较，模型组大鼠的关节液MMP-3、MMP-9含量显著升高（P< 0.05），Ⅱ型胶原、E2 含量显著降低（P<0.05）；对模型组比较，中药组、西药组大鼠的关节液MMP-3、MMP-9 含量显著降低（P< 0.05），Ⅱ型胶原、E2 含量显著升高（P<0.05），且2 个治疗组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

膝骨性关节炎（KOA）的主要病理机制是膝关节软骨的退行性病变，多种因素均通过破坏关节软骨引起KOA。

炎症反应、软骨基质在KOA 中起到重要的作用。KOA 是一种无菌性炎症，以TNF-α、IL-1β、IL-9 升高为主要表现。TNF-α 可以促进软骨细胞凋亡，促进Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的降解，破坏软骨细胞，导致骨赘形成[9]。IL-1β 由软骨细胞、滑膜细胞、巨噬细胞等分泌生成，可以促进滑膜细胞的增殖和分化，促进软骨细胞凋亡，促进Ⅱ型胶原蛋白合成和强度下降，促进滑膜细胞和软骨细胞生成前列腺素E2 和胶原酶，引起滑膜炎症和软骨基质降解。研究[10]发现，KOA患者血清或关节液中IL-1β的表达较正常人群显著升高。IL-9主要由单核细胞分泌，可以引起软骨细胞死亡和软骨细胞外基质的降解。研究[11]发现，KOA患者血清中的TNF-α、IL-1β、IL-9水平较正常健康者显著升高，提示炎症因子是引起KOA 的重要危险因素。Ⅱ型胶原是软骨细胞外基质的主要成分，KOA 患者中Ⅱ型胶原降解增多，而合成减少，导致软骨基质破坏。基质金属蛋白酶（MMPs）可以促进软骨基质降解、抑制蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成，导致软骨细胞变性和软骨缺损。MMP-3 和MMP-9 是MMPs 的主要成员，主要在KOA 患者的滑膜细胞中表达，是引起KOA 的重要原因之一。研究发现，MMP-3 和MMP-9 在KOA 患者软骨组织中高度表达，而Ⅱ型胶原表达显著减少[12]，提示MMP-3和MMP-9可引起软骨细胞外基质的主要成分Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖降解，导致关节软骨破坏、退变。E2 可以促进成骨细胞增殖分化，促进Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成，保护软骨细胞外基质，对膝关节具有重要的保护作用[13]。

KOA属于中医学“痹症”“骨痹”的范畴。中医学认为“肾主骨生髓”“肝主筋，为罢极之本”“肾之和，骨也”“膝为筋之府”。KOA的核心基础为年老体虚、肝肾亏虚[14]。人至中老年，肝肾逐渐亏虚，肾虚不能主骨生髓，骨不得肾阴滋养，引起骨质脆弱而无法生长，肝主筋，肝血亏虚，不能濡养筋脉，不荣则痛。正气亏虚于内，风寒湿邪侵袭，或瘀血内生，痹阻筋脉，是本病发作的重要诱因。寒湿内侵或瘀血内生而痹阻筋脉，引起关节肿胀畸形，这与TNF-α、IL-1β、IL-9 等引起关节软骨膝关节骨赘形成，关节腔间隙狭窄的病理表现不谋而合。“肝主筋脉”“肾主骨”，KOA患者肝肾亏虚，无以濡养筋脉，与膝关节液Ⅱ型胶原蛋白、E2水平降低和MMP-3、MMP-9导致软骨基质破坏、降解不谋而合。因此，TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3 和MMP-9 在一定程度上代表了KOA的致病因子，Ⅱ型胶原蛋白和E2在一定程度上反映了KOA患者的正气和肝肾功能的强弱。

治病必求于本，因此，KOA 治疗主要在于补益肝肾以强筋骨，正所谓“正气存内，邪不可干”。肾气丸为补益肝肾的经典名方，方中：附子大辛大热，温阳助火，桂枝辛温，补肾阳，主气化，通血脉，附子和桂枝合用，寓阳中求阴之意；熟地黄滋阴补肾生精，山药养脾生精，吴茱萸助阳生精，熟地黄、山药、吴茱萸重用以滋补肝肾阴精；泽泻、茯苓淡渗利湿，牡丹皮活血化瘀，合桂枝可温通血脉。诸药合用，共奏补益肝肾，兼活血化瘀、淡渗利湿之功。本研究结果显示：与正常组比较，模型组大鼠的膝关节宽度和滑膜厚度增加，膝关节被动活动度、压痛阈值、热痛阈值减小，关节液中的TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9含量升高，Ⅱ型胶原、E2含量降低；与模型组比较，中药组大鼠的膝关节宽度和滑膜厚度减小，膝关节被动活动度、压痛阈值、热痛阈值增加，关节液中的TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9含量降低，Ⅱ型胶原、E2含量升高。表明肾气丸可以缓解KOA 疼痛，减轻关节内炎症反应，抑制骨质增生，抑制软骨基质的降解。

综上所述，肾气丸可以通过抑制关节内炎症反应，抑制关节软骨基质降解有效减轻KOA 大鼠软骨损伤，改善膝关节功能。

表4 各组大鼠关节液MMP-3、MMP-9、Ⅱ型胶原、E2含量的比较Table 4 Comparison of the contents of MMP-3，MMP-9，typeⅡcollagen，E2 in synovial fluid of various groups（±s）

表4 各组大鼠关节液MMP-3、MMP-9、Ⅱ型胶原、E2含量的比较Table 4 Comparison of the contents of MMP-3，MMP-9，typeⅡcollagen，E2 in synovial fluid of various groups（±s）

①P<0.05，与正常组比较；②P<0.05，与模型组比较

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