黄连对2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性及内质网应激相关蛋白表达的影响

詹玫琦， 周珊珊， 万晓刚

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510450；2.湖北中医药大学，湖北武汉 430065；3.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

肥胖已成为2 型糖尿病发病的危险因素之一。肥胖导致脂肪组织中脂肪含量增加、游离脂肪酸（NEFA）清除率降低，从而促使机体循环中的NEFA浓度升高[1]，长期高水平的NEFA在非脂肪组织（如胰腺、骨骼肌、肝脏）中对葡萄糖稳态的毒害作用被称为脂毒性[2]。已有越来越多的研究表明，脂毒性参与2型糖尿病的发病机制，并与大血管相关的糖尿病并发症（如冠心病、中风等）密切相关[3]。中药黄连运用于治疗糖尿病（消渴）已有1 400多年历史[4]，既往临床研究亦证明了黄连具有改善糖脂代谢紊乱的作用[5-6]。现代药理研究报道，在中药黄连中已发现100 多种有效成分[7]，其中，小檗碱[8-9]、黄连碱[10]、黄连多糖[11]等能通过多种信号通路改善2型糖尿病糖脂代谢紊乱，减轻糖毒性作用，但黄连对于脂毒性的作用机制尚不明确。为此，本研究通过建立高脂高糖饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立2 型糖尿病大鼠模型，研究黄连对2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性的调控作用，并探讨其相关内质网应激机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级健康雄性Wistar大鼠100只，体质量（140 ± 20）g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。饲养在湖北中医药大学SPF 级动物实验室内，室温为（25±3）℃，相对湿度为（55±5）℃，12 h 光照周期，自由进食饮水。本实验获得湖北中医药大学动物伦理委员会批准。

1.2药物取黄连药材2 kg（购于广州中医药大学第一附属医院药剂科，经万晓刚教授鉴定为正品，产地四川，批号：160201），加8 倍蒸馏水浸泡时间达1 h，煎煮3 次，混匀后用旋蒸仪将煎煮物浓缩成膏状，再将其冷冻为干燥粉末。1 g 黄连可提取0.23 g黄连药粉，密封冷藏保存。盐酸二甲双胍片，购于中美上海施贵宝制药有限公司，批号：H20023370。

1.3试剂STZ（美国Sigma 公司）；NEFA、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、总低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；多聚甲醛、苏木素染色液（武汉阿斯本生物技术有限公司）；活化转录因子4（ATF4）抗体、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）抗体（上海艾博抗贸易有限公司）；C/EBP同源蛋白（CHOP）抗体（美国CST公司）。

1.4仪器JPS-5血糖仪和试纸（北京怡成生物电子技术股份有限公司）；DR-200Bs酶标仪（无锡华卫德朗仪器有限公司）；TGL16c 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TGL-16冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器）；计数仪（中国科技大学中佳科技实业有限公司）；JT-12K 脱水机、JB-P5 包埋机、JB-L5冷冻台、JK-5摊片机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016 切片机（上海徕卡仪器有限公司）；DHG-9123A 烘干箱（上海一恒科学仪器有限公司）；CX-21 光学显微镜（深圳奥林巴斯工业有限公司）。

1.5造模、分组及给药将100 只Wistar 大鼠随机抽取20 只设为正常组，其余80 只设为造模组。正常组给予普通饲料喂养10 周。造模组给予高脂高糖饲料（其成分按质量分数配比：10%猪油、20%蔗糖、2%胆固醇、1%胆酸盐、67%普通饲料）喂养10周后，禁食不禁水12 h，一次性给予大鼠腹腔注射STZ 30 mg/kg[12]。造模5 d后尾静脉采血检测空腹血糖（FBG），重复测定3次FBG ≥11.1 mmol/L的大鼠即判断为糖尿病大鼠。成功造模大鼠共60 只。按血糖值随机分为3 组，分别为模型组、黄连组和二甲双胍组。分组后次日起所有大鼠称质量后给药。黄连组：根据《中药药理研究方法学》[13]及相应临床研究用量总结[14]评估，60 kg 成人的黄连给药用量为10 g/d，大鼠的用药剂量等于标准体质量与人使用剂量相乘，经过前期预实验研究探索，取预实验的中剂量，即成人与大鼠的折算系数为10，按60 kg成人的每日用药剂量计算得大鼠黄连粉灌胃剂量为0.4 g·kg-1·d-1；二甲双胍组：剂量参照具有较好的降糖降脂作用的相应研究[15]，给予盐酸二甲双胍0.2 g·kg-1·d-1灌胃给药；模型组和正常组：给予等体积蒸馏水灌胃。每日1 次，灌胃5 周。干预期间均采用普通饲料喂养，自由进食饮水。

1.6标本采集首次给药前空腹12 h，尾静脉采血测FBG。灌胃期间每周尾尖采血测一次FBG 并称质量。5 周后，空腹12 h，20 g/L 戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉采血制备血清标本，静置2 h，以3 000 r/min 离心15 min，所得血清用于测定血脂，剩余血清-80 ℃冰箱冻存待测。将大鼠仰卧固定，沿腹中线剪开，取出各组大鼠胰腺。

1.7血清生化指标检测将离心所得血清采用全自动生化分析仪测定TC、TG、HDL-C、LDL-C、NEFA的浓度，操作方法同说明书。

1.8免疫组织化学法检测大鼠胰腺CHOP、ATF4、GRP78蛋白的表达将胰腺组织切片进行脱蜡，置于四乙铵二乙酸钠（EDTA）缓冲液中修复，后在室温下放置于体积分数3%过氧化氢溶液避光孵育。用体积分数5%牛血清白蛋白（BSA）封闭20 min。用一抗（CHOP 1∶50，ATF4 1∶50，GRP78 1∶300 稀释）50 μL覆盖组织4 ℃过夜。隔天给予相应的二抗50 ～100 μL 37 ℃覆盖50 min。予50 ～100 μL新鲜配制的3，3’-二氨基联苯胺（DAB）溶液显色，苏木素复染，体积分数1%盐酸酒精分化1 s，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，进行采图。使用软件Image-Pro Plus对光密度值进行分析。

1.9统计方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。先对计量资料进行正态分布检验，如符合正态分布，多样本组间差异的分析方法选用单因素方差分析，进一步两两比较，数据方差齐者使用LSD法，方差不齐者釆用Dunnett’s T3法；若不符合正态分布，则采用非参数秩和检验Kruskal-Wallis 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1各组大鼠灌胃前后体质量和FBG值的比较表1结果显示：治疗前，3 组糖尿病大鼠体质量均低于正常组（P＜0.05），FBG值均高于正常组（P＜0.05）。治疗后，3组糖尿病大鼠体质量仍有不同程度的下降。与正常组比较，模型组大鼠体质量明显下降，FBG 值明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，黄连组体质量上升，二甲双胍组体质量下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），黄连组、二甲双胍组FBG 值均下降（P＜0.05）。

表1 各组大鼠治疗前后体质量、空腹血糖（FBG）值比较Table 1 Comparison of body mass and FBS value in various groups before and after treatment （±s）

表1 各组大鼠治疗前后体质量、空腹血糖（FBG）值比较Table 1 Comparison of body mass and FBS value in various groups before and after treatment （±s）

①P<0.05，与正常组比较；②P<0.05，与模型组比较

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2. 2各组大鼠治疗后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平的比较表2 结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C、NEFA 水平明显上升（P＜0.05），HDL-C 水平明显下降（P＜0.05），表明模型组大鼠表现为高血脂；与模型组比较，黄连组血清TG、TC、LDL-C、NEFA 水平下降（P＜0.05），HDL-C 水平升高（P＜0.05），二甲双胍组血清LDL-C、NEFA 水平下降（P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05），且2个治疗组之间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.3各组大鼠胰腺组织中GRP78、CHOP、ATF4蛋白表达水平的比较图1 ～4 结果显示，与正常组比较，模型组大鼠胰腺组织中GRP78、CHOP、ATF4蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）；经黄连和二甲双胍干预后，大鼠胰腺组织中的GRP78、CHOP、ATF4蛋白表达水平均明显下降（P<0.01），且2 个治疗组之间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组大鼠治疗后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平的比较Table 2 Comparison of serum TG，TC，HDL-C，LDL-C and NEFA in various groups after treatment（±s，mmol·L-1）

表2 各组大鼠治疗后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平的比较Table 2 Comparison of serum TG，TC，HDL-C，LDL-C and NEFA in various groups after treatment（±s，mmol·L-1）

①P<0.05，与正常组比较；②P<0.05，与模型组比较

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图1 各组大鼠胰腺GRP78的表达分布（免疫组织化学法，×200）Figure 1 Comparison of distribution of GRP78 expression in pancreas of rats from various groups（by immunohistochemical method，×200）

图2 各组大鼠胰腺CHOP的表达分布（免疫组织化学法，×200）Figure 2 Comparison of distribution of CHOP expression in pancreas of rats from various groups（by immunohistochemical method，×200）

图3 各组大鼠胰腺ATF4的表达分布（免疫组织化学法，×200）Figure 3 Comparison of distribution of NEFA expression in pancreas of rats from various groups（by immunohistochemical method，×200）

图4 各组大鼠胰腺GRP78、CHOP、ATF4蛋白表达水平比较Figure 4 Comparison of expression levels of GRP78，CHOP，ATF4 proteins in pancreas of rats from various groups

3 讨论

在现今许多2型糖尿病患者中，多数都处于超重或肥胖状态，经常可见高血脂与高血糖并存[16]。这些患者体内长期存在脂质稳态失衡（以TG、LDL-C升高和HDL-C降低为特征）[17]，会加快动脉粥样硬化的形成，显著增加糖尿病相关的心、脑血管风险。本研究采用的高糖高脂饮食合STZ注射诱导的2型糖尿病大鼠模型[18]，模拟了糖脂代谢紊乱的环境，能有效地构建与人发病时相同的模型，利于观察与干预。祖国医学将2型糖尿病纳入“消渴”范畴，中药黄连在消渴中的运用历史悠久，历代医家皆认为黄连是治疗消渴之良药，单用有效。《名医别录》记载黄连“止消渴”，《肘后备急方》用一味黄连蜜丸治消渴尿多，《千金要方》《普济方》《外台秘要》等均有关于黄连治疗消渴的记载。现代医家中，仝小林[19]、闫镛[20]等均有使用黄连治疗糖尿病的经验。根据最新药理研究，中药黄连能有效改善肝脏脂毒性[21]，但对胰腺脂毒性的研究尚未明确。因此，本研究使用中药黄连进行干预，探讨黄连对2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性的作用。

众所周知，β细胞功能障碍是2型糖尿病发病机制之一，而糖脂毒性能加重β细胞功能障碍。加拿大1项为期6年的随访研究中[22]显示，血清NEFA水平与胰岛β 细胞功能之间存在负相关性，且NEFA 的血清浓度是预测β细胞功能降低的有力指标。同时，许多体外研究也证明，高脂状态不仅减少机体循环中NEFA的清除率，同时还释放更多的NEFA 进入循环中[23]，而高糖状态也会刺激β 细胞内脂解，促使NEFA 直接在胰腺中生成并蓄积，对胰岛β细胞产生脂毒性作用，加重胰岛β细胞功能障碍[24]。本研究通过构建以高糖高脂饮食诱导的2 型糖尿病大鼠模型，结果发现模型组的血清FBG、TG、TC、LDL-C 和NEFA 水平显著高于正常组，HDL-C 水平低于正常组，而二甲双胍组血清中FBG、TG、TC、LDL-C 和NEFA 水平较模型组明显下降，HDL-C 水平较模型组升高，以上结果表明经高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠存在血糖和血脂代谢紊乱，且模型组NEFA水平较正常组上升，也证实了NEFA 引起的脂毒性对2型糖尿病发病机制的影响。而应用中药黄连灌胃后，糖尿病大鼠血清FBG、TG、TC、LDL-C和NEFA水平显著下降，HDL-C 水平显著升高，这提示黄连能够有效地改善2型糖尿病大鼠血糖及血脂水平，并降低循环中NEFA水平，减轻脂毒性的作用。

目前，脂毒性作用影响2型糖尿病加剧发生发展的机制较为复杂，主要与炎症反应[25]、线粒体功能障碍[26]、内质网应激[25]和氧化应激[27]相关。越来越多的证据表明，内质网应激在2型糖尿病的发病机制中占据重要位置，并与糖脂毒性有关[28]。内质网在脂质生物合成以及分泌蛋白的合成和折叠中起着核心作用。正常生理状态下的胰岛β细胞通过信号转导促使内质网折叠合成胰岛素原，但在糖脂毒性的激发下，内质网腔中容易积累未折叠或者错误折叠的蛋白质，这种未折叠的蛋白反应（UPR）即是内质网应激中的一种表现。UPR有3条经典信号转导通路，研究较多的是蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）通路。GRP78是内质网中的分子伴侣，是内质网应激激活的标志物[29]。当内质网出现应激反应时，PERK蛋白磷酸化，介导转录因子ATF4 翻译增加，当ATF4 进入细胞核内，激活下游相关因子，促使CHOP蛋白的表达[30]，进而导致细胞走向凋亡进程。本研究结果显示，模型组大鼠胰腺中GRP78、CHOP、ATF4 蛋白的表达水平较正常组显著上升，这提示2型糖尿病大鼠内质网应激状态已被激活；而经黄连灌胃后的大鼠胰腺GRP78、CHOP、ATF4 蛋白的表达水平较模型组均明显下降，表明黄连组可改善内质网应激状态。因此，推测中药黄连对胰腺脂毒性的调控作用可能通过改善内质网应激机制减少NEFA在胰腺细胞中的堆积来实现。

综上所述，应用中药黄连进行干预后可有效改善高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱，减轻胰腺脂毒性程度，且其作用机制可能与减轻内质网应激，进一步减少胰岛细胞走向凋亡有关。本研究的意义在于初步探讨了中药黄连对高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性的调控作用及内质网应激相关蛋白表达的影响，这为黄连的临床应用提供良好的实验证据。但本研究仍存在一定的不足，今后有待深入分析内质网应激凋亡途径中的ASK1/JNK 及Caspase-12的激活途径、就中药黄连中具体哪一有效部分对血脂有切实改善作用进行有效验证、就中药黄连的有效成分如何进入细胞影响内质网应激通路进行研究，等等。