肉豆蔻挥发油抑菌作用研究

蒋 鸣

(江苏医药职业学院，江苏 盐城 224500)

肉豆蔻是肉豆蔻科植物肉豆蔻 (MyristicafragransHoutt.)的成熟干燥种仁，又称肉果、玉果，是一种药理活性较强的食物，也是一种天然香料[1-2]。肉豆蔻性温、味辛，可治疗脾胃虚寒、久泻不止，其挥发油也具有一定的药理活性，近年来也受到了广泛关注。然而，关于肉豆蔻挥发油的研究大多还是集中在挥发油组成成分上，只有较少数集中在其抑菌性、抗氧化性等性质上，这限制了肉豆蔻挥发油的开发利用[3]。

食品原料在生产、运输、贮藏等过程中会被微生物污染，许多微生物会残留在食品中，导致食品卫生不合格甚至腐败，对人们的身体健康造成了极大威胁。其中，金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黄曲霉、酿酒酵母菌是引起食物腐败的重要因素[4-5]。部分植物挥发油对微生物的抑制作用较好且安全性高，具有很大抑菌潜力，肉豆蔻挥发油就是其中一种。故本研究采用蒸馏法提取了肉豆蔻挥发油并对其抑菌作用进行了初探，为进一步利用肉豆蔻挥发油提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

肉豆蔻：购于盐城某药材市场；石油醚、无水乙醚、无水硫酸钠(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母菌(Saccharmoycescerevisiae)、黄曲霉(Aspergillusflavus)；培养基：LB培养基(细菌使用)、YPD 培养基(真菌使用)。挥发油提取器 上海玻璃仪器厂；TG328A分析天平；BGZ-240电热鼓风干燥箱 上海东星实验设备厂；RE-5203旋转蒸发器 上海青浦沪西仪器厂；BD240恒温培养箱 德国 Binder公司；752紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 肉豆蔻预处理

将肉豆蔻置于表面皿中，在干燥箱中于60 ℃进行烘干2 h取出，降至室温后用粉碎机粉碎，过40目筛，立即装进密封袋中以防吸水，储存待用。

1.3 肉豆蔻挥发油提取

称取肉豆蔻粉末50 g，置于1000 mL平底烧瓶中，加入适量的蒸馏水润湿，放置过夜，水蒸气蒸馏4 h，收集馏出液，馏出液用石油醚(30～60 ℃)萃取3次，在萃取液中加入适量无水硫酸钠低温干燥24 h后过滤，将滤液旋转蒸发，使石油醚挥发，得到肉豆蔻挥发油。

1.4 菌悬液的制备

将活化后的金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母菌接种在LB培养基和YPD 培养基中，3种细菌在36 ℃培养24 h，2种真菌在28 ℃培养48 h。取各供试菌的菌悬液，用无菌蒸馏水稀释合适倍数，通过平板计数法确定菌液浓度，使菌液浓度在107～108CFU/mL内。在无菌培养基中滴入0.1 mL菌悬液，用无菌涂布环制成均匀的含菌平板，待用[6]。

1.5 供试品溶液的制备

以1%的吐温80水溶液为溶剂，将1.3制备的肉豆蔻挥发油分别配制成2.0，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，120.0，160.0 mL/L稀释液[7]。

1.6 最低抑菌浓度(MIC)的测定

取各浓度供试品溶液10 mL，分别加入50 μL的菌悬液，缓慢摇匀制成肉豆蔻挥发油与菌悬液的混合液。移取0.2 mL该混合液于无菌平板中，用涂布环均匀涂布，倒置培养(3种细菌在36 ℃培养24 h，2种真菌在28 ℃培养48 h)。肉眼观察平板，有菌体生长为阳性(+)，“+”越多表示菌体生长越多；无菌体生长为阴性(-)，找出未长菌的最低浓度，即为最低抑菌浓度(MIC)，重复3次。

1.7 抑菌圈的测定

将1.3制备的肉豆蔻挥发油与无水乙醚按体积比为1∶1混合均匀得混合液，用无菌镊子小心夹取灭菌的圆状滤纸片(直径d=0.5 cm)，浸入上述混合液中，20 min 后取出，晾干。将滤纸片贴在各供试菌平板上，每个平板贴3片，呈“品”字形。以无水乙醚作为空白对照，将平板倒置培养，分别在1，2，3，4，5，6 d后取出平板，测量抑菌圈直径大小，取平均值。

1.8 对菌体生长曲线的影响

采用比浊度法测定菌体生长曲线，在分光光度计上测定菌悬液的吸光度值，通过吸光度来推算菌液的浓度。将1.3制备的肉豆蔻挥发油与无水乙醚混合，加入菌悬液，制成肉豆蔻挥发油浓度为0.5%和1%、含菌量为1×107CFU/mL的培养基；阴性对照为不含肉豆蔻挥发油、含菌量为1×107CFU/mL的培养基。将3种细菌培养基置于36 ℃，2种真菌培养基置于28 ℃，均以150 r/min的速度振荡培养12 h，在此期间每1 h取一次样，测定菌液在600 nm处的吸光度值并记录。将时间作为横坐标，将读取的吸光度平均值(n=3)作为纵坐标，得供试菌体的生长曲线[8]。

1.9 数据分析

用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析法统计分析肉豆蔻挥发油对不同种属菌株抑菌活性的强弱，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 肉豆蔻挥发油的MIC

根据1.6的方法测定肉豆蔻挥发油的MIC，结果见表1。

表1 肉豆蔻挥发油对各菌种的MICTable 1 The MIC of nutmeg volatile oil on tested strains

由表1可知，肉豆蔻挥发油对5种不同类型供试菌种均有一定的抑制作用[9]，且抑菌活性与肉豆蔻挥发油浓度基本呈正相关。当肉豆蔻挥发油浓度相当低时(2.0 mL/L)时，其对5种供试菌种均没有明显的抑制效果；当浓度渐渐增大时，其开始对各菌种出现不同程度的抑菌作用，平板中菌体减少；当其浓度较高时(160.0 mL/L)，对5种供试菌种均起到良好的抑制效果，平板中无菌体长出。肉豆蔻挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黄曲霉和酿酒酵母菌的MIC分别是20.0，40.0，40.0，160.0，160.0 mL/L。总体来讲，肉豆蔻挥发油对细菌的抑菌活性高于真菌[10]。

2.2 肉豆蔻挥发油的抑菌圈结果

根据1.7的方法测定抑菌圈直径，其中对无水乙醚空白对照组的抑菌圈进行测定，发现无抑菌圈，即抑菌圈直径为0；肉豆蔻挥发油的抑菌圈直径结果见表2。

表2 肉豆蔻挥发油对各菌种的抑菌圈Table 2 The inhibitory zone of nutmeg volatile oil on tested strains

由表2可知，肉豆蔻挥发油对5种不同类型供试菌种均有一定的抑制作用。肉豆蔻挥发油对细菌的抑菌圈大于真菌，即对细菌的抑制效果好于真菌，该结果与2.1一致。随着培养时间的延长，抑菌圈直径先增大后减小，5种供试菌的抑菌圈直径均在第3天达到最大值，且与其他时间的抑菌圈直径形成显著性差异。根据研究结果[11-12]，抑菌圈直径大于20 mm时为极敏；16～20 mm为高敏；11～15 mm为中敏；8～10 mm 为低敏；小于8 mm为不敏感。故肉豆蔻挥发油对金黄色葡萄球菌为极敏；对枯草杆菌为中敏；对大肠杆菌为高敏；对黄曲霉为低敏；对酿酒酵母菌为低敏[13]。肉豆蔻挥发油对5种供试菌的抑菌效果为：金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草杆菌>酿酒酵母菌>黄曲霉。

2.3 肉豆蔻挥发油对菌体生长曲线的影响

不同浓度肉豆蔻挥发油对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响见图1。

图1 不同浓度肉豆蔻挥发油对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响Fig.1 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Staphylococcus aureus

由图1可知，金黄色葡萄球菌在经过肉豆蔻挥发油处理后生长曲线发生了非常明显的变化，且1%肉豆蔻挥发油效果略好于0.5%肉豆蔻挥发油。在2 h后，金黄色葡萄球菌快速增长，直至10 h时相对趋于稳定；经过肉豆蔻挥发油处理后，金黄色葡萄球菌增长一直非常缓慢，抑制作用明显。

不同浓度肉豆蔻挥发油对枯草杆菌生长曲线的影响见图2。

图2 不同浓度肉豆蔻挥发油对枯草杆菌生长曲线的影响Fig.2 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Bacillus subtilis

由图2可知，枯草杆菌在经过肉豆蔻挥发油处理后生长曲线与阴性对照相比发生了明显变化，且高浓度效果略好于低浓度。在1 h后，枯草杆菌快速增长，直至8 h时相对趋于稳定；经过肉豆蔻挥发油处理后，枯草杆菌在6 h前缓慢增长，6 h后菌体有所减少，抑制作用明显。

不同浓度肉豆蔻挥发油对大肠杆菌生长曲线的影响见图3。

图3 不同浓度肉豆蔻挥发油对大肠杆菌生长曲线的影响Fig.3 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Escherichia coli

由图3可知，大肠杆菌在经过肉豆蔻挥发油处理后生长曲线发生了明显变化，抑菌效果仍与浓度成正比。在2 h后，大肠杆菌快速增长；经过肉豆蔻挥发油处理后，大肠杆菌增长一直非常缓慢，有良好的抑制作用。

不同浓度肉豆蔻挥发油对黄曲霉生长曲线的影响见图4。

图4 不同浓度肉豆蔻挥发油对黄曲霉生长曲线的影响Fig.4 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Aspergillus flavuus

由图4可知，黄曲霉在经过肉豆蔻挥发油处理后生长曲线发生了非常明显的变化，且1%肉豆蔻挥发油效果略好于0.5%肉豆蔻挥发油。在2 h后，黄曲霉快速增长，在7 h时相对趋于稳定；经过肉豆蔻挥发油处理后，黄曲霉在6 h前增长一直非常缓慢，但在6 h后菌体生长速度较快，在11 h后趋于稳定[14]。总体来看，肉豆蔻挥发油对黄曲霉的抑制作用差于上述3种细菌。

不同浓度肉豆蔻挥发油对酿酒酵母菌生长曲线的影响见图5。

图5 不同浓度肉豆蔻挥发油对酿酒酵母菌生长曲线的影响Fig.5 Effects of different concentration of nutmeg volatile oil on growth curve of Saccharmoyces cerevisiae

由图5可知，酿酒酵母菌在经过肉豆蔻挥发油处理后生长曲线发生了非常明显的变化，仍与浓度成正比。在2 h后，酿酒酵母菌快速增长；经过肉豆蔻挥发油处理后，酿酒酵母菌在5 h前增长一直非常缓慢，但在5 h后菌体生长速度较快，在11 h后又略有下降。总体来看，肉豆蔻挥发油对酿酒酵母菌的抑制作用差于上述3种细菌，但略优于黄曲霉。

3 结论

本实验考察了肉豆蔻挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黄曲霉和酿酒酵母菌的抑菌活性。MIC结果表明肉豆蔻挥发油具有良好的抑菌活性，对5种供试菌的抑菌效果为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草杆菌>酿酒酵母菌>黄曲霉。故对于这5种供试菌来说，肉豆蔻挥发油对细菌的抑制效果优于真菌。抑菌圈实验结果表明肉豆蔻挥发油对5种供试菌的抑菌效果均为先增大后减小，在第3天达到最佳抑菌效果。生长曲线结果表明肉豆蔻挥发油显著改变了5种供试菌的生长曲线，抑制了供试菌生长和增殖，进而发挥 了抑菌效果。研究结果为肉豆蔻挥发油的高值化利用以及其应用范围的扩大提供了理论依据。