细胞外囊泡在心血管疾病中的研究进展

李 洋，赵明镜，王保福，韩小婉，孟 慧

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是指细胞释放的，具有膜结构的微小囊泡的统称，几乎所有类型的细胞均可分泌[1]，在体液中广泛存在，如血液、唾液、脑脊液、尿液、汗液、腹水、乳液和羊水中均可检测到[2-3]。EVs携带来源于其母细胞的生物信息“货物”，主要包括DNA、信使RNA(mRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)及蛋白质[1，4-5]，这些生物信息被磷脂双分子层包裹，以防在胞外空间丢失[4]。释放到胞外空间的EVs到达靶细胞周围后，首先通过膜上的整合素、凝集素/蛋白聚糖、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4(Tim4)与靶细胞识别并结合，之后靶细胞通过内吞作用、膜融合及与受体特异结合3种方式摄取EVs携带的“货物”，最终靶细胞对摄取的EVs内容物进行内化，产生特定的生物学效应，实现细胞之间通讯，进而影响疾病的病理生理进程[5-6]。根据直径大小、来源及生成方式不同将EVs分为3类：外泌体(exosomes，Exos)、微粒和凋亡小体，详见表1。

表1 细胞外囊泡主要类型

近年来，关于EVs在疾病中作用的研究主要集中在癌症、神经退行性疾病、糖尿病及心血管疾病等领域[4]。现综述EVs在心血管病中的作用，包括EVs分类、产生方式及不同来源的EVs(外泌体和微粒)在心血管疾病尤其是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)中的作用等，以期为EVs在心血管疾病发展中的病理机制、临床应用及防治心血管疾病提供新思路。

1 外泌体

外泌体是直径为30～200 nm的脂质双分子层囊泡，形成过程涉及细胞内吞作用、质膜双重内陷和多泡体形成[11-12]。在生理或病理条件刺激下，质膜第一次内陷形成内吞小泡，此时液体和细胞外成分(主要是蛋白质、脂质、代谢物、小分子和离子)通过内吞作用和质膜内陷与细胞表面蛋白一起进入细胞内，进入细胞内的多个内吞小泡融合形成早期核内体(early-sorting endosomes，ESEs)。之后ESEs内吞细胞质中的线粒体、内质网、高尔基体和核酸(DNA、mRNA、lncRNA及miRNA)，发育为晚期核内体(late-sorting endosomes，LSEs)。LSEs质膜在内吞体转运复合体(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)蛋白作用下进行二次内陷形成多个大小不一的腔内小泡(inter-luminal vesicles，ILVs)，腔内小泡大小不同提示其内包含的信息不同，这使得最终形成的外泌体具有高度特异性。通过ESCRT蛋白先确定腔内小泡大小之后选择适合的货物，还是先由ESCRT蛋白选择好特定的货物之后由货物含量决定腔内小泡大小尚无统一定论[13]。因含腔内小泡的LSEs外观形似多囊泡，因此称为多泡体(multivesicular bodies，MVBs)。相关研究发现，多泡体主要有两种结局：一是与自噬体和溶酶体融合从而被降解，降解产物被细胞回收；二是借助细胞骨架及微管网络运输到质膜，通过多泡体对接蛋白停靠在质膜腔侧，再通过胞吐方式将腔内小泡释放到胞外空间，这些被释放到胞外空间的腔内小泡称为外泌体[5，12，14]，至于多泡体如何选择两种结局机制目前尚不明确。由于双重内陷过程，外泌体中膜拓扑结构与细胞质膜拓扑结构一致[4，15]。

参与外泌体生成的蛋白主要有ESCRT蛋白、调节真核细胞内小泡运输的Rab蛋白、细胞骨架蛋白、凋亡相关基因2-相互作用蛋白X(ALIX)、四跨膜蛋白(CD9、CD63和CD81)、热休克蛋白(HSP)、黏附分子、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)和肿瘤易感基因101(TSG101)、多泡体对接蛋白、磷脂、神经酰胺、鞘磷脂酶和可溶性马来酰胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)[4，12]。外泌体普遍存在的标志物包括ALIX、四跨膜蛋白(CD9、CD63和CD81)、LAMP1、TSG101及SNARE[12]。

除普遍存在的标志物外，重要的是外泌体携带不同母细胞的生物信息及在不同病理状态下发挥的作用。根据Exo Carta的外泌体数据库(http://www.exocarta.org)记载，对286个不同类型的细胞和生物体来源的外泌体研究发现了9 769种蛋白质、3 408种mRNA、2 838种miRNA和1 116种脂蛋白。

心血管领域目前主要集中于外泌体miRNA作用方面的研究。已了解到的来源于内皮细胞、血小板、干细胞、心肌细胞、免疫细胞及脂肪细胞释放的外泌体，现按照不同来源的外泌体在心血管疾病中作用进行介绍[14，16]。

1.1 内皮细胞来源外泌体 根据产生的条件及包含的miRNA不同，内皮细胞来源的外泌体(endothelial cell-derived exosomes，EC-Exos)对心血管系统不但具有抗损伤的保护作用[17-19]，也能促进斑块形成，加重心血管负担。

有研究发现，在缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)条件下，将心肌细胞与人脐静脉内皮细胞来源外泌体(human umbilical vein endothelial cell derived exosomes，HUVEC-Exos)共同培养后，HUVEC-Exos可激活心肌细胞丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK1/2)信号通路，增加心肌细胞对缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤的抵抗能力，明显降低心肌细胞死亡率[17]。一项研究表明，长期运动或层流剪切力增加能上调含miR-342-5p的EC-Exos表达，miR-342-5p能抑制I/R后心脏的凋亡信号[半胱天冬酶9(Caspase-9)及氨基末端激酶2抗体(JNK2)]并增强生存信号[磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)]表达，产生内源性心脏保护作用[18]。在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)诱导下，HUVECs分泌富含miR-155外泌体，可促进单核/巨噬细胞由抗炎的M2型转化为促炎的M1型，加重动脉粥样硬化病变形成[19]。

1.2 血小板来源外泌体 血小板来源外泌体(platelet-derived exosomes，P-Exos)含有多种miRNA、血小板特有糖蛋白、细胞因子、凝血因子及生长因子，参与炎症、血栓形成、组织损伤和修复、血管生成及动脉粥样硬化等多种病理机制[20-23]。

有研究发现，富含miR-223的P-Exos具有心脏保护和抗炎作用，通过抑制细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8、IL-12、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等促炎介质释放，减少动脉粥样硬化斑块形成并预防缺血性心脏微血管内皮细胞迁移和增殖[11，21]。通过抑制巨噬细胞CD36表达，P-Exos使巨噬细胞不能吞噬ox-LDL和胆固醇，减少泡沫细胞形成，从而发挥抗动脉粥样硬化作用[24]。来自富血小板血浆的外泌体(PRP-Exos)不仅通过调控磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和MAPK-Erk信号通路及血管生成因子，促进内皮细胞增殖和迁移，诱导血管生成，还可激活转录共激活蛋白(YAP)，促进成纤维细胞增殖和迁移，增加胶原合成，促进伤口愈合[23]。

1.3 干细胞来源外泌体 干细胞来源的外泌体具有促进心肌细胞增殖、抑制细胞凋亡、促血管生成、抗纤维化、改善心功能等作用[25-27]。目前心血管领域研究较多的包括造血干细胞、间充质干细胞、心脏祖细胞及胚胎干细胞来源的外泌体。

CD34+造血干细胞分泌的外泌体富含促进血管生成的miR-126-3p，可调控血管内皮生长因子、血管生成素1、血管生成素2、基质金属蛋白酶9和血小板反应蛋白1等血管生成通路中相关基因的表达，促进内皮细胞增殖及血管生成[25]。

间充质干细胞来源的外泌体(mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos)在心血管疾病中具有旁分泌免疫调节、促血管生成、抗纤维化及增加心肌收缩力等作用[26]。有研究发现，MSC-Exos通过上调动脉粥样硬化小鼠体内miR-let7水平，显著抑制脂多糖诱导的M1型巨噬细胞表达，同时增加M2型巨噬细胞表达，减少动脉粥样硬化小鼠斑块面积及斑块中巨噬细胞浸润现象[28]。

心脏祖细胞(cardiac progenitor cell，CPC)是目前用于心脏修复的最佳干细胞类型之一，具有促进心肌细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管生成、抗心肌纤维化、减少梗死面积和瘢痕形成的作用，CPC对心脏的有益作用主要通过其分泌的外泌体(CPC-Exos)实现[27]。CPC-Exos含有丰富的miRNA，有利于细胞之间信号传递，是功能表达的重要物质基础。现已发现CPC-Exos中过表达的miRNA包括miR-132、miR-210、miR-21、miR-17、miR-103、miR-146a、miR-133a、miR-451、miR-20a、miR-15b、miR-181a和miR-323-5p，CPC-Exos通过这些miRNA在心脏疾病中发挥保护作用[27，29-30]。

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)具有分化为机体所有细胞类型的能力，促进心肌细胞增殖和血管生成，抑制细胞凋亡，抗纤维化[11]。有研究发现，ESC来源的外泌体所含的miR-294能诱导心肌保护反应，促进心肌梗死后CPC存活和增殖，进而恢复急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)小鼠心肌功能[31]。

1.4 心肌细胞来源的外泌体 心肌细胞来源的外泌体含量及种类随着细胞应激状态不同而变化，在AMI、血管紧张素Ⅱ生成增加、缺氧、炎症、损伤、葡萄糖饥饿或酒精过量等情况下，心肌细胞释放外泌体增加，根据携带的miRNA不同对受损心脏产生的作用不同。有研究发现，2型糖尿病大鼠受损心肌释放含有高水平的miR-320外泌体，心肌细胞通过外泌体将miR-320转移到内皮细胞发挥抗血管生成的功能[32]；心肌梗死小鼠模型发现心肌源性细胞分泌的外泌体表达miR-146a，具有促进血管新生、保护心脏的功能[33]。

1.5 免疫细胞来源的外泌体 免疫细胞既可作为供体细胞分泌外泌体发挥生物效应，又可作为受体细胞与其他细胞来源的外泌体结合，诱导适应性免疫或体液免疫的发生。免疫细胞来源的外泌体已证明有助于抗原呈递和免疫细胞调节，B细胞和树突状细胞(dendritic cells，DCs)分泌的外泌体具有主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类和Ⅱ类功能，成熟DCs分泌的外泌体可将MHC-Ⅰ类蛋白复合物转移至邻近的DCs，增强免疫反应[30，34-35]。

成熟的DCs来源外泌体以类似于脂多糖方式，通过膜表面TNF-α介导的核因子κB(NF-κB)途径诱发HUVECs炎症，并能使ApoE-/-小鼠AS病变明显加重[35]。单核/巨噬细胞来源的外泌体将miR-155转移至内皮细胞中，上调ICAM-1、趋化因子配体2(CCL2)和IL-6等促炎因子表达，增强细胞间黏附，促进泡沫细胞形成[20，36]。一项研究发现，心肌梗死后M1型-巨噬细胞(促炎型)释放大量外泌体(M1-Exos)，M1-Exos能抑制去乙酰化酶1/腺苷酸活化蛋白激酶α2(Sirt1/AMPKɑ2)-内皮型一氧化氮合酶和Rac家族小GTP酶1-P21活化激酶2(RAC1-PAK2)信号通路，降低ECs血管生成能力，加重心肌损伤，抑制心脏愈合[37]。

1.6 脂肪组织来源的外泌体 正常情况下脂肪组织来源的外泌体(adipose-derived exosomes，Ad-Exos)被脂肪组织的巨噬细胞摄取，Ad-Exos中的三酰甘油被巨噬细胞分解为脂肪酸并将其释放，维持机体全身代谢稳态。当机体脂肪过多时这种平衡被打破，过多的Ad-Exos导致巨噬细胞活化、促进炎性因子释放并导致全身胰岛素抵抗[38]。

有研究发现，高脂喂养的ApoE-/-小鼠内脏脂肪组织分离出的外泌体可下调ATP结合盒转运体(ABCA1和ABCG1)介导的胆固醇外泄，显著促进M1型巨噬细胞泡沫细胞生成，同时促炎性因子(TNF-α和IL-6)增加，导致动脉粥样硬化病变加重[39]。一项研究发现，Ad-Exos中主要发挥作用的miRNA是miR-34a，它将营养超载信号传递给脂肪常驻巨噬细胞，从而通过抑制转录调节因子锌指蛋白Krüppel样因子4(Klf4)表达和巨噬细胞向M2型(抗炎型)极化，加剧肥胖诱导的全身炎症和代谢失调[40]。

2 微粒(microparticles，MPs)

微粒是直径为100 nm至1 μm的膜性小囊泡，由质膜以类似出芽方式产生。细胞双层膜通过磷脂不对称性分布维持脂质：靠近胞外空间侧富含磷脂酰胆碱和鞘磷脂，而靠近胞质侧主要由磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰乙醇胺形成。细胞活化、凋亡或受到其他刺激时，细胞内Ca2+浓度增加激活了ATP介导的磷脂促翻转酶，导致细胞双层膜磷脂重新分布，即PS被转运至外侧膜，而磷脂酰胆碱被转运至内侧膜，促进质膜突起成泡。之后钙蛋白酶被激活，降解成泡部位质膜的细胞骨架，使母细胞突起的膜作为独立囊泡(包含母细胞的核酸、蛋白质和脂质)分裂到胞外空间[4，41]。

参与微粒形成的蛋白主要包括磷脂促翻转酶、钙蛋白酶、ADP-核糖基化因子6(ARF6)、细丝蛋白、踝蛋白、半胱天冬酶及凝溶胶蛋白；若微粒是以类似于病毒出芽方式从质膜脱落时，上述蛋白发挥作用同时还需TSG101及抑制蛋白域蛋白1(ARRDC1)参与[4，41]。关于微粒的研究主要集中于其表面含有地来源于母细胞特征性蛋白，但无论来源如何，由于生成过程中PS外移至微粒表面均带有负电荷。

微粒具有强大的促凝作用，这是由于带有负电荷的PS外翻后通过Ca2+结合活化的凝血因子，从而促进凝血酶产生[42]；微粒具有促炎及促进内皮功能障碍作用，这些均导致动脉粥样硬化及血栓形成，而动脉粥样硬化和血栓形成是多种心血管疾病发展的病理因素[41，43-44]。

2.1 内皮细胞微粒 高三酰甘油、糖尿病、高血压和代谢综合征等心血管疾病危险因素表达水平升高时，刺激内皮细胞释放大量的内皮细胞微粒(endothelial microparticles，EMPs)[45-46]。EMPs发挥的作用主要是诱发炎症[47]、促进凝血[41]，导致内皮功能障碍和血管生成[8]，促进动脉粥样硬化进展和血栓形成[45]。

在微血管止血和血栓形成中EMPs发挥重要的作用。有研究发现，在动脉粥样硬化中CD40L阳性表达的EMPs可增强内皮细胞增殖，促进体内新生血管形成，从而导致斑块内出血[48]；另一方面EMPs促进纤溶酶原产生纤溶酶，使纤溶酶具有纤溶活性，起到溶解血栓作用[47]。

ox-LDL能刺激内皮细胞释放携带ICAM-1的EMPs，增加内皮细胞与单核细胞黏附，促进小鼠主动脉斑块形成[49]。来自衰老冠状动脉内皮细胞和急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)病人EMPs通过血管紧张素Ⅱ诱导1型受体(AT1R)激活，从而导致还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活MAPKs和PI3K通路，诱导内皮细胞过早功能障碍、衰老和血栓形成[50]。

2.2 白细胞微粒(leukocyte microparticles，LMPs) LMPs来源于粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞，具有促进炎症反应、修饰内皮功能、促凝、促进血栓形成及易损斑块内新生血管形成的作用[47，51]，几乎参与动脉粥样硬化形成的所有阶段。

LMPs的共表达标记物是CD45，单核细胞、淋巴细胞和粒细胞释放的微粒标记物分别是CD14、CD4和CD15[8，52]。有研究发现，与正常人比较，无症状亚临床动脉粥样硬化病人循环LMPs水平明显增高[53]。Leroyer等[54]对动脉粥样硬化病人微粒水平分析后发现，斑块中微粒较血浆含量更多，微粒大多数来自白细胞(52.9%)，其中29.5%来自CD14+巨噬细胞，15.3%来自CD4+淋巴细胞，8.1%来自CD66b+粒细胞。与斑块稳定病人比较，有不稳定斑块的病人CD11b、CD66b、LMPs水平明显增高，可独立预测斑块不稳定性[55]。

LMP能增加IL-1β、IL-8、CD40配体、MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类蛋白复合物及ICAM-1表达，从而诱导白细胞激活、内皮细胞增殖、斑块内新血管形成及单核细胞黏附和迁移[52-53]，加重动脉粥样硬化病理活动，且动脉粥样硬化血栓风险高的病人血流LMPs与血管壁长期接触可能导致血管壁整体恶化[51]。

2.3 血小板微粒 血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)是由活化的血小板释放，具有凝血、止血和促进血栓形成的作用，心血管疾病病人外周血循环中PMPs水平高于冠状动脉循环[56-57]。PMPs富含多种膜蛋白，这些膜蛋白(如GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、p-选择素、整合素等)在凝血过程中发挥重要作用[41，58]。PMPs可促进内皮和单核细胞炎症反应，在不利于血流条件下促进白细胞相互作用和单核细胞浸润，并与LMPs共同促进血栓形成[59-61]。有研究表明，PMPs可直接与内皮细胞相互作用促进血管再生，或激活内皮祖细胞，促进内皮修复[36]。miR-142-3p在血小板和PMPs中均高度表达，可靶向内皮细胞促进内皮细胞增殖，参与高血压病人内皮功能障碍[62]。

PMPs除是血小板活化的标志物外，还可增强血小板和纤维蛋白在动脉粥样硬化动脉壁上沉积，促进血小板黏附，进一步补充血小板，促进血栓形成，参与动脉粥样硬化性疾病的发生发展[47，57]。除典型作用外，PMPs还参与创伤愈合、炎症反应、糖尿病、关节炎、组织再生和癌症等多种疾病过程[47，57]。

3 凋亡小体(apoptotic bodies，ApoBDs)

ApoBDs是凋亡细胞以细胞泡形式释放到胞外空间，直径为1～4 μm的膜性囊泡[2，59]。细胞凋亡时，细胞膜皱缩内陷形成囊泡，膜内包含凋亡核原料，表面标记物为碘化丙啶阳性和PS阳性[63]。根据细胞类型不同，凋亡膜突起从死亡细胞膜上以多种形式伸出，主要包括微管尖刺、凋亡原体和珠状凋亡原体，这些突起释放ApoBDs进入胞外液体中[9]。有研究表明，ApoBDs的形成有助于清除凋亡细胞，与其他EVs亚群一样，ApoBDs具有转运核酸或蛋白质等物质，促进细胞间通讯能力的作用[63-65]，但关于ApoBDs在心血管疾病中的研究较少。

4 EVs的临床应用

由于EVs携带母细胞信息，在特定生理和病理条件下发生变化，并释放到所有可检测到的细胞外液中，因此，EVs一方面可作为多种疾病诊断和预警的生物标志物，另一方面可作为药物载体或直接在治疗中发挥作用。

4.1 在疾病诊断中作用 由于EVs在体液中获取的简便性，其有可能成为诊断心血管疾病的新方法。与正常人相比，冠心病病人血液CD31+、CD42+、EMPs和CD144+、EMPs水平均明显增高，同时心肌梗死病人与心绞痛病人循环中两种EMPs发现，心肌梗死病人循环中两种EMPs表达量更高，结果提示CD31+、CD42+、EMPs和CD144+、EMPs对冠心病具有潜在的诊断价值[66-68]。一项研究证明，ACS病人血清外泌体miRNA-208a表达增高，且miRNA-208a表达水平越高的ACS病人生存率越低，提示miRNA-208a可能作为ACS诊断或预后指标[2，69]。

4.2 在治疗中的作用 治疗方面，EVs主要通过两种途径：一种是将已确定有治疗作用的干细胞EVs直接干预疾病以达到治疗目的，如大量临床试验已证明间充质干细胞或心脏祖细胞分泌的外泌体能保护心肌组织，抑制心肌细胞凋亡，改善心肌梗死后心功能[17，26，27]；另一种是利用EVs可跨越血脑屏障具有细胞靶向的特性将药物装载入EVs内应用于治疗，这样可保护药物的生物信息物质免受降解酶破坏及在循环中的稳定性[4，5，36]。

5 小结与展望

综上所述，EVs含有丰富的母细胞来源的生物信息，可反映母细胞特定状态，同时EVs可介导细胞间通讯，调节邻近或远端靶细胞功能，从而调节疾病的病理生理过程，并在心血管疾病进展中发挥重要作用。现有研究证明，含有miRNA的外泌体或具有特异性蛋白的微粒在机体表达水平可预测心肌梗死、冠心病、糖尿病和肿瘤等，且由于EVs在体液中广泛存在、获取简便，有望于成为心血管疾病的新型标志物。EVs在疾病的病理机制成为新的研究热点，特别在细胞间、器官间通讯方面成为重要的信息交流载体，且EVs可将临床和基础相结合。目前EVs研究仍处于起步阶段，且关于EVs的诊断及治疗方面作用多是动物实验及细胞实验，同时由于临床研究样本量有限，得到的结论不具有说服力，且关于外泌体和微粒分离、检测及纯化的研究方法无统一标准，这使得人们对EVs在临床应用中的认同不够。针对这些问题，国际细胞外囊泡学会提出了EVs研究的最低限度指南(MISEV)[1]，该指南包括EVs命名法、收集和预处理、分离和纯化、EVs表征、功能研究及实验研究综合报告6个要点，详细介绍了关于EVs科学研究遵循的主要事项，强调了常见的误解及方法学缺陷，为EVs研究制定了统一的国际规范。因此，临床研究应遵循该指南，使EVs的研究更规范，从而更好地为临床研究和基础研究服务。