白介素17在心房颤动模型大鼠中的作用机制研究

谢 建，梁珊珊，宋 波，秦忠心，彭俊秋，王 冰，赵大奎

心房颤动是临床常见的心律失常之一，易导致心力衰竭、脑卒中等并发症[1]，给家庭和社会带来沉重负担，因此，明确心房颤动的发生发展机制对预防和治疗心房颤动有重要意义。心房纤维化被认为是心房颤动发生与维持的关键因素[2]。心房纤维化主要是心肌细胞外基质重构。多种炎症细胞及炎性因子参与心肌细胞外基质重构[3]。辅助性T细胞17(T helper 17，Th17)是近年来新发现的一种由TH0细胞在转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素23(IL-23)和白介素21(IL-21)刺激下分化而成CD4+T细胞亚群，主要分泌白介素17(IL-17)而发挥促炎作用[4]，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要意义[5]，而干扰素、白介素4(IL-4)、细胞因子信号传送阻抑蛋白3可抑制TH0细胞分化为TH17细胞[6]。

TH17细胞在自身免疫中发挥重要作用。相关研究证实，IL-17、白介素1(IL-1)、IL-6及干扰素在心力衰竭、病毒性心肌炎、动脉粥样硬化等多种疾病中发挥重要的调节作用[7-8]。已有研究表明，心房颤动动物IL-17高表达，IL-17可促进T细胞激活并刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子、化学增活素及细胞黏附分子1(cellular adhesion molecule 1，CAM-1)，从而导致炎症发生[9]。IL-17是T细胞诱导炎症反应的早期启动因子，通过促进释放前炎性细胞因子放大炎症反应，并参与心房纤维化[10]。但IL-17是否来源于Th17细胞，如何促进心房颤动纤维化过程尚无报道。本研究拟证实Th17细胞在心房颤动动物模型中高表达，且通过分泌IL-17调控核转录因子κB(nuclearfactorκB，NF-κB)而促进心房纤维化过程，从而为心房颤动治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.2 构建SD大鼠心房颤动模型 按随机数字表法将40只雄性SD大鼠(体重250～300 g)分为对照组(20只)和心房颤动组(20只)。实验时两组大鼠均应用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉并气管插管，连接心电监护。心房颤动组使用食道电极经口送入食管比邻心房处，电极连接电生理仪，设置电生理仪参数(电压20 V，电流4 mA，脉宽6 ms)，通过电生理仪发放脉冲波快速起搏心房，每次刺激30 s，间隔5 min，待恢复窦性心律再次刺激，每日5次，通过心电监护确认心房颤动发作以明确心房颤动模型构建成功。记录心脏心电图详细情况，心房颤动发生时间以P波消失并出现典型心房颤动波为标志，以恢复窦性心律作为心房颤动终止，期间即为SD大鼠造模后心房颤动持续时间。对照组仅在麻醉后给予气管插管和心电监护，不进行食道心房刺激。

1.3 SD大鼠标本采集

1.3.1 心房颤动血液标本收集 两组大鼠在实验开始前、实验第5天和第10天经鼠尾静脉取血1 mL，立即注入EDTA抗凝管并充分摇匀，以2 000 r/min离心20 min后分离血浆与血细胞，将血浆分装于-80 ℃低温冰箱保存。

1.3.2 组织标本收集 于实验第10天以1%戊巴比妥钠腹腔深度麻醉后将SD大鼠前胸壁打开，快速取出心脏，置于生理盐水中去除血液，取50 mg左右心房组织置于4%多聚甲醛容器内保存，剩余心房组织放置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 血浆IL-17含量 使用大鼠 IL-17 ELISA试剂盒检测两组大鼠血浆IL-17蛋白水平表达。所有血浆样品检测均重复进行，以确保变异系数(CV)<10%，具体操作步骤按照说明书进行。

1.5 实时定量聚合酶链式反应(Real-Time PCR)检测心房组织IL-17表达 应用Real-Time PCR检测心房组织IL-17基因水平表达，具体步骤包括Trizol提取总RNA、琼脂糖电泳检测其完整性、分光光度计测定纯度和浓度。按照试剂盒说明书进行，检测心肌组织IL-17表达情况。以β-actin为内参照，分析基因相对表达量。具体引物序列，SD大鼠 IL-17：正向引物5′-TCGTAACGTACCAGACG-3′，反向引物5′-CCGTGTACAGTCATGG-3′；SD大鼠β-actin：正向引物5′-ACTGATCGCCACCGCAG-3′，反向引物5′-ACCACAGTGTGCCGATCTGG-3′。

1.6 流式细胞术分选心房组织浸润的淋巴细胞 为明确IL-17来源，取病变区的心肌组织，眼科剪刀剪碎，采用胰酶和胶原酶反复消化，待组织彻底裂解为单个细胞后，用400目的尼龙网去掉上清液中团块，再应用红细胞裂解液去除红细胞，用PBS洗涤后制成单细胞悬液。所得细胞以佛波醇酯类多克隆刺激剂(PMA) 50 ng/mL，钙离子载体(Ionomycin) 1 μg/mL刺激，同时加入蛋白转运抑制剂(Monensin) 1 μg/mL，置于37 ℃、5%CO2中培养4 h。收集细胞后依次进行表面抗原染色PE-抗大鼠CD3单抗和APC-标记抗大鼠CD4单抗，流式细胞仪上应用活细胞分选技术分选CD4+细胞(辅助T淋巴细胞)和CD3+其他成熟T淋巴细胞，应用流式软件FlowJo VX10统计辅助T淋巴细胞占所有成熟T淋巴细胞比例。将流式分选后CD3+/CD4+细胞(辅助T淋巴细胞)和CD3+/CD4-的其他成熟T淋巴细胞收集并培养，校准细胞数量后，培养24 h后应用ELISA试剂盒检测上清液IL-17蛋白水平。

（5）数据分析、处理功能，平台能够通过对各个经销商的经营数据进行分析处理，为生产厂商提供精细化的营销运营方案；

1.7 IL-17单克隆抗体干预SD心房颤动大鼠 按随机数字表法将60只雄性SD大鼠(体重250～300 g)分为对照组(20只)、心房颤动组(20只)和心房颤动干预组(20只)。实验时3组大鼠均采用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉并气管插管，连接心电监护。构建大鼠心房颤动模型。心房颤动干预组除上述处理外每48 h经腹腔注射大鼠IL-17单克隆抗体100 μg。详细记录心脏心电图情况。

1.8 SD大鼠心房颤动参数 在SD大鼠离体心脏的心尖和右心房处分别连接电极，利用Langendorff离体心脏灌流系统灌注离体SD大鼠心脏，同时测量生物电。生物电刺激由固定在心房壁上的电极发放，每8个S1刺激后给予一个S2刺激，且不断缩短S1、S2刺激间期间隔，最终S2刺激落在1个S1刺激的心房肌有效不应期内，从而S2刺激不能产生心跳，这个时间间隔即心房肌有效不应期。测定3组SD大鼠心房肌有效不应期，同时统计3组大鼠动作电位时程。

1.9 大鼠心脏组织Masson染色 心脏组织切片经二甲苯及不同浓度乙醇水化至蒸馏水，Masson染色液中媒染1 h，Weigert氏铁苏木素染20 min，自来水清洗，0.5%盐酸乙醇分化30 s，丽春红-品红液染色10 min，充分水洗，脱水、透明、封片。

1.10 Western Blotting检测 应用RIPA裂解心脏组织，组织破碎仪震荡，以12 000 r/min离心20 min，去上清进行蛋白浓度测定，再用6 X上样缓冲液制样。上样90 V恒压电泳，之后以400 mA恒流将蛋白电转到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭PVDF膜1 h。封闭结束后，在含5%BSA的TBST中抗体4℃过夜，二抗室温结合2h，加入显影液曝光显影。

2 结 果

2.1 对照组和心房颤动组血浆IL-17含量比较 心房颤动组SD大鼠血浆IL-17含量高于对照组，差异有统计学意义(P=0.009)。详见图1。

与对照组比较，*P<0.01。图1 对照组和心房颤动组血浆IL-17含量比较

2.2 对照组和心房颤动组IL-17基因表达比较 心房颤动组心房组织IL-17基因表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。详见图2。

与对照组比较，*P<0.001。图2 对照组和心房颤动组IL-17基因表达比较

2.3 对照组和心房颤动组SD大鼠心脏组织辅助T淋巴细胞比例比较 运用流式细胞术分选心房组织浸润的淋巴细胞，筛选并统计CD3+/CD4+辅助T淋巴细胞占成熟T淋巴细胞比例。对照组辅助T淋巴细胞占成熟T淋巴细胞比例为(13.27±1.73)%，心房颤动组辅助T淋巴细胞占成熟T淋巴细胞比例为(50.12±4.56)%，两组比较差异有统计学意义(P=0.007)。详见图3。

图3 对照组和心房颤动组SD大鼠心脏组织辅助T淋巴细胞比例比较

2.4 对照组和心房颤动组SD大鼠T淋巴细胞亚群IL-17水平比较 对照组CD3+/CD4-成熟T淋巴细胞上清液IL-17水平较低，为(0.11±0.03)ng/L，心房颤动组为(0.19±0.06)ng/L，CD3+/CD4+细胞(辅助T淋巴细胞)培养上清液IL-17水平升高，为(0.39±0.04)ng/L，表明心房颤动组血清高水平IL-17主要来源于CD3+/CD4+辅助T淋巴细胞。详见图4。

组内比较，*P<0.05；组间比较，#P<0.01。图4 对照组和心房颤动组T淋巴细胞亚群IL-17水平比较

2.5 3组SD大鼠心电图相关参数比较 刺激期心房颤动组20只SD大鼠均发生心房颤动，心房颤动发生率为100%，心房颤动波持续时间为(48.80±1.54)s，表明心房颤动模型构建成功。心房颤动干预组20只SD大鼠仅16只发生心房颤动，心房颤动发生率80%。心房颤动组平均心率高于对照组(P<0.05)；而给予IL-17抗体干预后SD大鼠平均心率显著降低，与心房颤动组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。心房颤动组SD大鼠房性期前收缩、房性二联律、房性三联律刺激间歇期频发出现；给予IL-17抗体干预后SD大鼠刺激间歇期房性期前收缩、房性二联律、房性三联律较心房颤动组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 3组SD大鼠心电图相关参数比较

2.6 3组SD大鼠心房不应期和动作电位时程比较 心房颤动组SD大鼠心房不应期较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而给予IL-17抗体干预后SD大鼠心房不应期较心房颤动组增加，差异有统计学意义(P<0.05)。心房颤动组SD大鼠心房动作电位时程较对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而给予IL-17抗体干预后SD大鼠动作电位时程较心房颤动组增加，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 3组心房不应期和动作电位时程比较(±s) 单位：ms

2.7 3组SD大鼠心房组织间质纤维化比较 利用Masson染色检测心房纤维化水平，结果显示：对照组SD大鼠心房组织间质纤维化较少，而心房颤动组SD大鼠心房组织间质纤维化较对照组增加，差异有统计学意义(P<0.01)；给予IL-17抗体干预后SD大鼠心房组织间质纤维化水平较心房颤动组降低，差异有统计学意义(P<0.01)。详见图5、图6。

图5 3组心房纤维化Masson染色结果

与心房颤动组比较，*P<0.01。图6 3组SD大鼠心房组织间质纤维化比较

2.8 3组SD大鼠心房组织纤维化相关蛋白水平 Western Blotting结果显示：心房颤动组TGF-β1、α-SMA、MMP-9表达水平显著增加，表明心房颤动时心房组织纤维化程度增加。给予IL-17抗体干预后SD大鼠心房组织纤维化相关蛋白TGF-β1、α-SMA、MMP-9表达水平较心房颤动组显著降低，表明抑制IL-17介导的炎症可改善心房组织纤维化及心房颤动发生。详见图7。

图7 3组心房组织纤维化相关蛋白水平比较

3 讨 论

心房颤动是常见的持续性心律失常，也是心房电重构的结果，而心肌纤维化导致心房电重构，心脏电活动发生和传导异常是促进心房颤动发生的重要原因[11-12]。本研究通过SD大鼠心房颤动模型确定心房颤动发生时IL-17高表达，且通过流式分选技术确定辅助T淋巴细胞 IL-17的主要来源。IL-17家族包括6个成员配体(IL-17A～IL-17F)和5个受体[13]，有研究发现，IL-17和IL-17受体结合后，通过MAPK途径和NF-κB途径发挥生物学作用[14-15]。

给予心房颤动SD大鼠抗IL-17中和抗体后，发现心房颤动大鼠心房不应期延长，且心间质纤维化减轻，表明降低心房组织炎症可改善心房间质纤维化，且分子水平结果显示心房组织纤维化相关蛋白TGF-β1、α-SMA、MMP-9表达水平较心房颤动组显著降低，本研究结果揭示辅助性T细胞17分泌的IL-17在心房收缩功能障碍、心肌细胞重构和疾病进展中发挥重要作用，提示抗炎可能是心房颤动的治疗途径之一。

初始CD4+T细胞接受抗原刺激后，不同条件下可分化为不同亚型T细胞，发挥不同功能，其分化方向受抗原性质、局部环境激素及细胞因子等多种因素调控[15]，其中细胞因子种类和细胞因子之间平衡对T淋巴细胞的分化具有重要的调节作用[16]。TGF-β1和IL-6共同诱导分化T淋巴细胞为辅助T淋巴细胞Th17，分泌IL-6和IL-17，参与炎症反应和自身免疫性疾病[17]。本研究结果显示：Th17参与心房颤动等心律失常疾病。在此过程中，T细胞相关受体分子及转录子均发挥重要作用。许多转录因子如Foxp3可特异性调控Th17细胞活化[18]，因此，通过调控转录因子表达及加入炎性因子可中和抗体抑制T细胞的增殖活化，是改善心房颤动的重要途径。

近期研究发现，CD4+、CD25+调节T细胞可抑制T淋巴细胞产生IL-2和γ干扰素(IFN-γ)，明显促进IL-17产生[19]，当加入抗转化生长因子β(TGF-β)中和性抗体时，可抑制IL-17产生[20]。本研究结果表明，加入抗IL-17中和性抗体心房组织纤维化显著改善，今后将进一步分析TGF-β中和性抗体在心房组织纤维化中的作用，明确炎症在诱导心房颤动发生中的作用。

综上所述，实验性大鼠心房颤动模型中，心房组织IL-17基因水平和蛋白质水平均升高，且辅助T淋巴细胞Th17是心房颤动时高水平 IL-17的主要来源，IL-17与心房颤动发生和发展有关。IL-17是一种具有强大的聚集中性粒细胞的前炎性细胞因子，可促进多种细胞释放炎性因子，在心房组织重塑及心房间质纤维化过程中发挥重要作用，是调节心房颤动发生的重要靶点。