康达心口服液对射血分数保留心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

吴 翔，张婷婷，乔建峰，熊尚全

射血分数保留心力衰竭(ejection fraction preserved heart failure，HFpEF)是以心脏舒张功能受损为主要表现的临床综合征。目前，HFpEF在心力衰竭病人比例已超过50%，且呈升高趋势。如何有效延缓和逆转HFpEF病人进程，改善转归，已成为慢性心力衰竭治疗的最大挑战[1]。中医药治疗HFpEF疗效确切，本研究通过构建HFpEF大鼠模型，基于心肌纤维化角度，探讨康达心口服液对HFpEF大鼠心肌纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 30只无特定病原体级(SPF级)SD大鼠，体重150～200 g，由福建中医药大学实验动物中心提供。所有动物实验过程均遵循动物伦理学相关规定。

1.1.2 实验药物与试剂 康达心口服液(福建中医药大学附属人民医院院内制剂)，主要成分：附子、黄芪、葶苈子、猪苓、当归；转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗体一抗和二抗均购自美国CST公司；N末端B型钠尿肽原(NT-proBNP)试剂盒购自美国Vigenebio公司。

1.1.3 实验仪器 小动物呼吸机，TKR-200C厦门欣锐仪器仪表有限公司生产；Visual Sonic Vevo 2100®型小动物超声成像系统，加拿大Visual Sonics公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 HFpEF模型：大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，高位结扎腹主动脉以复制动物模型。于大鼠腹部正中线开口，逐层开腹，暴露并分离腹主动脉，以大鼠右侧肾动脉上方2～3 mm腹主动脉处为结扎点，使用4-0的带针线结扎，造成腹主动脉结扎点内径缩窄；结扎后心脏表面即刻给予利多卡因注射液1～2滴，缝合关闭腹腔；关腹后腹腔滴注2%的青霉素/链霉素溶液。术后第12周，即造模HFpEF大鼠模型。假手术组给予相同手术方法，穿线但不结扎腹主动脉。

1.2.2 实验分组 将30只SD大鼠称重后随机分为3组：假手术组(sham组)、心力衰竭组(HFpEF组)、心力衰竭干预组(HFpEF+I组)。HFpEF+I组大鼠灌胃2.7 mL/(kg·d)康达心口服液；假手术组、心力衰竭组灌胃等量生理盐水。3组大鼠均连续灌胃12周。

1.3 观察指标

1.3.1 心功能评估 治疗12周后，应用心脏超声测量各组大鼠舒张早期二尖瓣血流速度与舒张晚期二尖瓣血流速度比值(E/A)、舒张早期二尖瓣血流速度与舒张早期二尖瓣环运动速度比值(E/e′)，评估大鼠心脏舒张功能，采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠NT-proBNP水平，评估心功能。

1.3.2 心脏组织收集 处死大鼠前测量体重，处死后立即取出心脏，并测量心脏、左室重量，计算心脏重量/体重指数(Hw/W)、左室重量/体重指数(LVw/W)。取出1 mm3面积的心肌组织迅速置于10%的甲醛中固定24 h后，石蜡包埋组织切片(4 μm)，进行苏木精-伊红(HE)染色，并观察心肌组织胶原纤维含量、分布及心肌纤维化。

1.3.3 心肌纤维化评估 分别提取各组大鼠心脏组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，并进行制胶、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显影，数据分析，应用Western Blotting分别检测各组大鼠心脏组织TGF-β1蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 3组大鼠心功能指标比较 与sham组比较，HFpEF组和HFpEF+I组大鼠E/A比值明显降低，NT-proBNP水平、E/e′升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与HFpEF组比较，HFpEF+I组E/A比值升高，NT-proBNP水平、E/e′降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 3组大鼠心功能指标比较(±s)

2.2 3组大鼠心脏重量比较 与sham组比较，HFpEF组Hw/W、LVw/W均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与HFpEF组比较，HFpEF+I组Hw/W、LVw/W均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.3 3组大鼠心脏组织纤维化比较 电镜下观察各组大鼠HE染色心肌组织，与sham组比较，HFpEF组和HFpEF+I组大鼠心脏组织心肌纤维化程度增加；与HFpEF组比较，HFpEF+I组大鼠心脏组织心肌纤维化程度明显减轻。详见图1。

图1 3组大鼠心肌组织心肌纤维化程度

2.4 3组大鼠心肌组织TGF-β1蛋白表达比较 与sham组比较，HFpEF组和HFpEF+I组大鼠心脏组织TGF-β1蛋白表达均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与HFpEF组比较，HFpEF+I组大鼠心脏组织TGF-β1蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1及图2。

图2 3组大鼠心肌组织TGF-β1蛋白表达

3 讨 论

心肌纤维化导致心肌顺应性下降是HFpEF重要的病理生理机制，心肌纤维化尤其是早期心肌纤维化多影响心脏舒张功能[2-3]。在心肌纤维化的发生发展过程中，组织内细胞外基质(extracellular matrix，ECM)异常增多和过度沉积发挥了关键作用[3]。TGF-β1促进心肌纤维化作用得到证实。TGF-β1通过调控心肌成纤维细胞和ECM代谢平衡，从而促进心肌纤维化及HFpEF发生发展[4-7]。将小鼠TGF-β1基因剔除后，其胚胎发生和发育中出现血管缺陷[8]，提示TGF-β1不仅参与维持正常内皮稳态[3]，而且在胚胎形成、纤维化和创伤愈合等过程中均参与血管发生[9-11]。

HFpEF属中医学“喘症”“心水”“胸痹”等范畴，病机总属本虚标实，心为“君主之官”，主血脉，心之气阳不足，心血瘀阻，水饮内停，痰饮为阴邪，心肾阳虚不能化水，水饮上凌于心肺，则见气促、咳嗽、咳痰，又常因外感、内伤、劳累等加重。相关研究发现，HFpEF以阳虚血瘀兼痰饮证者居多[12]。康达心口服液是福建中医药大学附属人民医院根据多年经验方制成的院内制剂，君药附子、黄芪温肾暖土，益气健脾；臣药葶苈子、猪苓定逆止喘、渗泄水邪；佐药当归温通血脉、活血行气。前期研究已证实，康达心口服液治疗慢性心力衰竭疗效显著，其可能机制为降低慢性心力衰竭病人血清基质金属蛋白酶9水平，增强心肌收缩力，增加心排血量[13]；抑制细胞凋亡，降低肿瘤坏死因子α、白介素6水平，改善心脏重构等[14-15]。基于“温阳益气，化瘀利水”的治则，前期研究将康达心口服液应用于HFpEF病人的治疗，结果发现，在标准治疗基础上联合康达心口服液能降低HFpEF病人E/e′，升高E/A比值，并降低血清NT-proBNP水平[16]。

本研究通过建立HFpEF大鼠模型，结果证实：康达心口服液可降低HFpEF大鼠E/e′比值，升高E/A比值，并降低血清NT-proBNP水平。进一步研究发现康达心口服液能降低HFpEF大鼠心脏组织TGF-β1表达，这可能是康达心口服液抑制心肌纤维化，改善心脏舒张功能的机制。今后将进一步探讨康达心口服液对心肌组织TGF-β1相关信号通路的影响，揭示康达心口服液治疗HFpEF的具体机制。