用分子对接研究肟类及苯丙素衍生物抗乙肝病毒机理

王卫京，詹世平，丁仕强

（大连大学 环境与化学工程学院，辽宁大连 116622）

乙型肝炎是感染乙肝病毒（HBV）引起的临床常见的传染性疾病，乙肝病毒在人体内连续不断的复制会引起肝脏病变，严重危害患者健康。抗乙肝病毒常见的药物有核苷类似物和干扰素，这些药物只能功能性抑制乙肝病毒。长期以来，研究人员一直在探索抗乙肝病毒的机理，开发新的抗乙肝病毒的药物。

娄晓月采用体外筛选，研究了10种中药化合物体外抗乙肝病毒的活性及其作用机制。崔新华等设计了一系列新型结构的肟及肟类衍生物，测试了其体外抗乙肝病毒活性，研究了其对表面抗原 （HBsAg）与 e 抗原 （HBeAg）的半数抑制浓度 IC50 值。Liu 等则研究了苯丙素衍生物的抗乙肝病毒活性，测试了该类衍生物对表面抗原 （HBsAg）与 e 抗原 （HBeAg）的IC50值。王勇翔通过生物学和结构生物信息学确认了乙肝病毒聚合酶的新功能区，研究了该功能区的作用机制，寻求抑制乙肝病毒聚合酶的药物。

分子对接是大规模药物分子虚拟筛选的重要方法，广泛应用于药物研究与设计领域。该方法通过计算机模拟将小分子（配体）放置于大分子靶点（受体）的结合位点，根据空间构象和相互作用在结合位点内不断定位并寻找最佳匹配状态。分子对接方法也被许多研究者用于抗乙肝病毒活性有效成分的筛选。姚香草用分子对接筛选了鸡骨草抗乙肝病毒的活性成分，并进行了体外抗HBV 活性评价。Meng 等利用同源建模的方法构建了乙肝病毒DNA 聚合酶三维结构，以此为靶点通过分子对接研究了马蹄金素及其衍生物的抗乙肝病毒活性。Vijayakumar Subramaniyan 等利用分子对接筛选了40种药物植物成分，认为杠香藤酸是一个合适的抗乙肝病毒的候选药物。

乙肝病毒HBV 基因有4 个开放阅读框，编码7 个蛋白，其中的乙肝病毒聚合酶，核衣壳蛋白以及x 蛋白HBx 在病毒复制过程中起重要作用。乙肝病毒聚合酶在核衣壳蛋白包装成核衣壳颗粒中起关键作用，在乙肝病毒复制过程中将子代RNA 逆转录成DNA。核衣壳蛋白能够自组装成核衣壳颗粒，并调节核衣壳内逆转录反应。HBx 蛋白可以调节多条信号通路，实现促进乙肝病毒的逆转录和其DNA 复制，并调节细胞周期，是一个多功能调节蛋白。

由于核衣壳蛋白、乙肝病毒聚合酶和HBx 蛋白在乙肝病毒复制过程中均起重要作用，本文利用分子对接技术，将肟类衍生物及苯丙素衍生物同这三种蛋白进行对接，得出其结合自由能，然后再和实验值对比，分析这些化合物在抑制乙肝病毒活性时的作用靶点，从而对其抗乙肝病毒的机理进行研究。

1 资料与计算方法

分子对接采用的肟及肟类衍生物配体来自崔新华等的研究文献，苯丙素衍生物配体来自Liu 等的研究文献。用ChemDraw和Chem3D 绘图软件画出配体分子3D 结构，采用MM2力场对配体的分子构象进行能量优化，然后将其保存为mol2格式，作为分子对接的配体。用LeDock 分子对接软件进行分子对接。在文献[2]和[3]中，研究人员分别测出了化合物对HBsAg 和HBeAg 活性抑制的IC50值，本研究将其转化为与蛋白质的结合自由能，并将其与分子对接的计算值进行对比。

在蛋白质数据库（http：//www.rcsb.org）中下载PDB ID为5E0I 的乙肝病毒核衣壳晶体的结构，如图1所示。目前尚未解析出乙肝病毒聚合酶的三维结构，本研究利用SWISSMODEL 网站对其进行同源模建。在美国国立生物技术信息中心（NBCI）数据库中查询序列号为BAQ95565.1的乙肝病毒聚合酶的一级序列，利用BLAST 程序在PDB 库中搜索，PDB ID 为6IK9的蛋白质与其同源性最高，以该蛋白质为模板对聚合酶进行建模，模型结构如图2所示。HBx 蛋白晶体结构目前也没有被解析出来，在PDB 库中没有找到与之同源性较强的蛋白质。该蛋白质氨基酸数目较少（154个），可以采用从头预测的方法建模。在NBCI 数据库中找到HBx 蛋白的序列号为BAQ95563.1，然后在从头预测网站QUARK 上对其进行建模，其三维结构如图3所示。

图1 核衣壳蛋白结构

图2 聚合酶模型结构

图3 HBx蛋白模型结构

2 结果与讨论

本研究通过分子对接，计算出配体与核衣壳蛋白、聚合酶蛋白和HBx 蛋白结合自由能。将配体抑制HBsAg 和HBeAg活性的IC50值转换，得出配体与靶蛋白结合自由能实验值。图4～图9 是对接值与实验值的对比。在6 个图中，配体与HBx 蛋白结合自由能的对接值和HBsAg 实验值之间数值比较接近，且变化趋势吻合，说明二者相关性较强。

图4 核衣壳蛋白对接值和HBsAg实验值对比

图5 核衣壳蛋白对接值和HBe实验值对比

图6 聚合酶对接值和HBsAg实验值对比

图7 聚合酶对接值和HBeAg实验值对比

图8 HBx蛋白对接值和HBsAg实验值对比

图9 HBx蛋白对接值与HBeAg实验值对比

表1 是对接值和实验值之间的均方差。对于配体与靶点蛋白的结合自由能，从表中可以看出，以HBx 为靶点得出的对接值和由HBsAg 半数抑制浓度IC50值求出的实验值之间的均方差最小，为2.63kJ2/mol2，这说明配体与HBx 之间的对接值和实验值最为吻合。

表1 对接值和实验值的均方差

从以上结果可以看出，虽然核衣壳蛋白，乙肝病毒聚合酶以及HBx 蛋白均对乙肝病毒的复制过程有重要作用，但肟类和苯丙素衍生物与之对接时，与HBx 蛋白的对接值在数值上与实验值相差最小，对接结果变化趋势与实验值变化最为一致，表明HBx 的对接值与实验值的相关性最强。由此可以推测，肟类和苯丙素衍生物可能是通过抑制HBx 蛋白起到抗乙肝病毒作用，其对HBsAg 抗原活性抑制更明显。HBx 蛋白通过多种方式促进HBV 的复制。其通过调节钙离子信号通路，促进HBV DNA 的复制和HBV 的逆转录。该蛋白具有反式激活作用，对病毒或宿主基因的启动子和增强子进行反式激活，调节HBV 的复制和转录过程。HBx 蛋白还可以调节细胞周期，为病毒创造一个有利于复制的内环境。肟类和苯丙素衍生物对HBx 蛋白具有抑制作用，则从多方面抑制了乙肝病毒的复制，从而起到抗乙肝病毒的作用。这也为开发抗乙肝病毒药物提供了新思路。

3 结束语

乙肝病毒编码的蛋白中，核衣壳蛋白、乙肝病毒聚合酶和HBx 蛋白在乙肝病毒复制过程中有重要作用。本研究采用分子对接技术，以肟类和苯丙素衍生物为配体，同三个蛋白进行对接，并将结合自由能的对接值和实验值进行对比，分析该化合物抑制乙肝病毒活性的机理。结果显示，以HBx 为靶点的对接值和HBsAg 的实验值吻合性较好，其变化趋势一致，二者之间的均方差最小，这表明肟类和苯丙素衍生物很可能是通过抑制HBx 蛋白进而抑制乙肝病毒的复制，显示出较强的抗乙肝病毒活性，该化合物对HBsAg 抗原活性的抑制作用更强。