PGRMC1联合血小板参数对浸润性乳腺癌早期诊断的研究

高恬媛，曹晓智，汪俊茹

（皖南医学院第二附属医院 病理科，安徽 芜湖）

0 引言

我国女性恶性肿瘤发病率中乳腺癌居首位，近十年发病率仍呈上升趋势[1]，在世界范围内亦是女性癌症死亡的第二个主要原因，女性乳腺癌的早期诊断预防则显得尤为重要[2]。研究认为内源性雌激素在乳腺的发育过程中起着重要作用，增加雌激素的敏感性或者更长时间使用雌激素可能会增加肿瘤发生的风险[3]。孕激素受体膜组分1（Progesterone Receptor Membrane Component 1, PGRMC1）是一种多功能蛋白，属于真核生物中广泛存在的膜相关孕酮受体（MAPR）蛋白家族，在乳腺癌细胞中过表达[4]。近期研究发现，乳腺癌患者雌激素水平较高，血液呈高凝状态，血小板参数明显改变，如PLT明显升高，而PLT升高与凝血功能激活有关。血小板活化后颗粒内容物、炎症介质等释放增加，血管通透性增高，参与血管新生，促进肿瘤细胞生长、逃逸[5-6]。本实验通过研究浸润性乳腺癌患者PGRMC1的表达与血小板参数的相关性，对乳腺癌的早期诊断提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年1月至2018年8月浸润性乳腺癌组标本60例，患者年龄26～78岁，平均（53.1±10.1）岁。乳腺良性肿瘤组织20例，患者年龄20～55岁，平均（38.5±10.2）岁。收集患者入院的血小板参数指标。所有病例均为女性，经临床病理确诊，术前均未行化疗、放疗，研究经过患者及家属同意，并签署知情同意书。

1.2 主要试剂

PGRMC1兔多克隆抗体购自美国Proteintech公司（编号：12990-1-AP）；免疫组化染色剂，显色剂及封闭试剂等均购自美国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化

Envision法将白片经二甲苯脱蜡，酒精梯度水化，柠檬酸热修复，3% H2O2封闭去除内源性酶，10%动物血清孵育，PGRMC1原液1:300稀释，室温孵育1 h；二抗室温孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，透明后封片。

1.3.2 血小板参数

采集患者入院后次日清晨外周血2 mL于EDTA抗凝管，希森美康（Sysmex）全自动血液分析仪XN-1000V检测血小板参数：血小板计数（PLT）、血小板压积（PCT）、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度数据（PDW）。

1.4 结果评定标准

PGRMC1定位于细胞浆，阳性细胞浆呈棕褐色，胞核蓝染，高倍镜下观察，依据染色阳性强度分为0分（无色），1分（淡黄色），2分（棕黄色），3分（深褐色）；依据阳性检出率划分，阳性细胞占肿瘤细胞比例<10%，10%～50%，50%～75%，>75%依次分为1～4分。染色强度乘检出率得到染色指数，<3 分为（–），3～5分（+），6～9分为（++），>9分为（+++），由两位高年资诊断医师双盲检出。

1.5 统计学处理

SPSS 20.0统计软件处理，Shapiro-Wilk检验是否符合正态分布，独立样本t检验或Mann-Whitney U秩和检验确定各指标组间差异是否有统计学意义，相关性分析采用Spearman秩相关，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PGRMC1在乳腺良、恶性肿瘤中的表达

由图1可明显看出，PGRMC1在浸润性乳腺癌胞浆中高表达，在乳腺良性肿瘤中弱表达。表1中可见，良性肿瘤组的PGRMC1几乎不表达强阳性（2组），浸润性乳腺癌组多表达为强阳性或者阳性，两组间的PGRMC1表达有显著差异（Z=-6.01,P<0.001）。

表1 乳腺良、恶性肿瘤患者PGRMC1表达差异

图1 PGRMC1在乳腺良恶性肿瘤中的表达（×100）

2.2 乳腺良、恶性肿瘤中血小板参数比较

表2可观察到较乳腺良性肿瘤组，PLT、PCT在浸润性乳腺癌中明显升高（P<0.05），PDW、MPV无明显差异性改变（P>0.05），提示血小板参数在浸润性乳腺癌和乳腺良性肿瘤中有较为明显改变。

表2 乳腺良、恶性肿瘤患者血小板相关参数差异性检验

2.3 PGRMC1与血小板参数的相关性

实验发现PGRMC1与PLT、PCT之间具有显著相关性（见表3），提示在进行乳腺良、恶性肿瘤研究中，PGRMC1与PLT、PCT高度相关，可以与血小板相关参数进行联合参考。

表3 PGRMC1与血小板相关指标间相关系数表

3 讨论

PGRMC1是细胞色素b5相关的血红素结合蛋白，具有Src同源性2和Src同源性3结构域蛋白的结合位点，参与血红素及亲脂性分子从质膜、内质网、线粒体等细胞器中转运[7]。大多数组织均可检测出，多种肿瘤组织中过表达，如乳腺、甲状腺、结肠、卵巢、肺癌等[8-9]。本实验发现PGRMC1在浸润性乳腺癌多表达为强阳性，良性肿瘤中弱表达，两组间表达有显著差异（Z=-6.01,P<0.001），说明在浸润性乳腺癌中PGRMC1表达明显增高。目前，国内外研究认为PGRMC1促进乳腺癌细胞中的信号转导，增加Akt活化和IκB磷酸化，导致NFκB活化，并且PGRMC1上存在PDK1结合区，Akt可以被PDK1蛋白激酶磷酸化。Neubauer H等[10]发现在卵巢癌细胞RMG细胞中，PGRMC1触发下游细胞内钙离子释放增加，使得PI3-K通过调节PKC活化环中氨基酸残基的PDK1依赖性磷酸化来促进PKC活性的调节进而引起丝裂原蛋白激酶（ERK）活化，随后导致不同的细胞反应，表明PGRMC1可能激活下游多种膜受体类型的通路，包括GPCRs、受体酪氨酸激酶和各种细胞因子受体等。

术前血小板参数可作为乳腺癌早期诊断和评估病情的指标，升高的PLT、PCT预示患者预后较差。本实验结果显示浸润性乳腺癌PLT、PCT均明显增高，且PGRMC1与PLT、PCT之间有显著相关性，而血小板活化可以通过PI3K-Akt通路激活，其中PDK1是该通路中重要作用位点[11-12]，PGRMC1又有其结合区域，可以使得Akt活化，猜想PGRMC1与血小板活化有共同通路，可以作为乳腺癌早期的诊断依据，是临床病理对浸润性乳腺癌研究的一个新的角度。近几年报道PGRMC1作为浸润性乳腺癌辅助诊断[12-13]，且发现其表达还与肿瘤大小、乳腺癌的临床分期、淋巴结转移有关，对乳腺癌预后具有重要指示作用[14-15]。本实验中PLT、PCT的升高可能由于浸润性乳腺癌患者的血小板数增加包裹癌栓形成，促进肿瘤细胞逃逸[5]，可能与肿瘤的淋巴结转移有关。

综上所述，浸润性乳腺癌患者的PGRMC1和血小板相关参数PLT、PCT明显升高，并且具有显著的相关性，可以为临床的乳腺癌早期辅助诊断提供参考。