分子标记辅助选育聚合烟草花叶病毒属病毒抗性基因（L4）及马铃薯Y病毒抗性基因（Pvr4）的甜椒自交系

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

我国是世界上辣椒栽培面积最大、产量最高的国家（http：//www.FAO.org）。辣椒已成为我国最大的蔬菜产业（王立浩 等，2019）。长期以来，病毒病一直是制约辣（甜）椒生产的主要因素之一。据报道，至少有20 余种主要的病毒可侵染辣椒和甜椒（Moury & Verdin，2012），其中烟草花叶病毒属病毒（Tobamovirus）和马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）是侵染辣椒最为普遍的病害，在我国多地辣椒产区均有检出（郭思瑶 等，2015；刘勇 等，2019），严重影响辣椒产量和品质。

辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）是烟草花叶病毒属的典型成员，烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）和番茄花叶病毒（tomato mosaic virus，ToMV）也是该病毒属病毒，在辣椒生产上发生十分普遍（王亚南，2008；秦蕾和梁燕，2016）。根据烟草花叶病毒属病毒和其抗性基因L的致病关系，可将其分为5 种致病型：P0、P1、P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4（García-Luque et al.，1990；Velasco et al.，2002；Antignus et al.，2008）。辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）最早在美国发现，我国于1994 年首次在新疆产区发现（向本春等，1994），之后在多地均有检测发现（黄粤 等，2005；李兴红 等，2005；夏惠娟 等，2006；Wang et al.，2006），检出比例较高。刘勇等（2019）于2013—2017 年对我国31 个省（市、自治区）开展辣椒主要病毒病发生情况调查，结果表明PMMoV检出比例仅次于TMV 和黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）。PMMoV 通过带毒种子、感病植株和感病土壤均可传播，病毒在干燥的植物病残体上可存活25 a，防治极为困难。抗病育种是防治该病毒病最有效方式之一。L系列等位基因（L1、L2、L3、L4）是烟草花叶病毒属的主要抗性基因（Boukema，1980，1982；Genda et al.，2007；Tomita et al.，2011），已在辣椒抗烟草花叶病毒属病毒育种上得到广泛应用。L4基因最早在辣椒种C.chacoense资源PI 260429 中被鉴定发现，该基因对烟草花叶病毒属病毒（TMV、ToMV、PMMoV）具有广泛抗性，除P1，2，3，4致病型外，对其余4种致病型均具有抗性（Genda et al.，2007）。国内外研究学者先后开发或转化获得与L4基因连锁的RAPD、AFLP、SCAR、SNP 各类型标记（Matsunaga et al.，2003；Kim et al.，2008；Yang et al.，2009，2012）。L基因特异分子标记的开发可以快速筛选鉴定含有L基因的抗性资源，提高抗病基因转育的效率。

马铃薯Y 病毒属于马铃薯Y 病毒属（Potyvirus），寄主广泛，可侵染马铃薯、烟草、番茄和辣椒等茄科作物，在世界范围内广泛发生。主要依靠蚜虫（以绿色桃蚜为主）以非持久方式进行传播（Green & Kim，1991；李宁 等，2018）。目前在辣椒上已鉴定出多个PVY 的抗性基因（Cook，1960；Dogimont et al.，1996；Caranta et al.，1999），其中Pvr4基因为显性，来源于辣椒材料CM334（Criollo de Morelos-334’，Dogimont et al.，1996），该材料对PVY 的所有3 个小种PVY（0）、PVY（1）、PVY（1，2）和PepMoV 均表现为抗病，还未有该基因抗性被克服的报道。目前已开发和报道了与PVY 抗性基因Pvr4连锁的RAPD、AFLP、SCAR、SNP 各 类 型 标 记（Caranta et al.，1999；Arnedoandrés et al.，2002；Devran et al.，2015），可应用于辣椒抗病材料辅助选择和抗病基因转育中。

本试验以创制聚合烟草花叶病毒属病毒抗性基因（L4）和马铃薯Y 病毒抗性基因（Pvr4）的甜椒自交系为主要目标，利用引进的抗源材料，采用常规回交转育、分子标记辅助选择（marker assisted selection，MAS）结合田间抗病性鉴定的方法，将抗性基因Pvr4和L4转育聚合到甜椒优异自交系83-163 中，为今后多抗辣（甜）椒品种的培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甜椒83-163 为中国农业科学院蔬菜花卉研究所辣椒课题组选育的大果型甜椒自交系，果实方灯笼形（纵径8.2 cm，横径7.1 cm），综合性状优良，早熟性好，中抗疫病和CMV，配合力强，是中椒系列品种的亲本之一，但其对PMMoV 和PVY 表现高感（图1）。CM334（引种号200380）和200375（引种号200375）均是本课题组2003 年从法国引进的种质资源，CM334 果实短锥形（纵径6.3 cm，横径2.5 cm），植株分枝性强，茎部绒毛明显，田间病毒病抗性好，人工接种PVY 致病型PVY（1，2）后，有过敏反应出现，PVY 抗性表现高抗，含有Pvr4抗性位点。200375（C.annuumL.）为一年生辣椒，L4抗性位点来自C.chacoense（PI 260429），为转育后经过高代分离的纯合材料，果实方灯笼形（纵径7.1 cm，横径6.5 cm），人工接种鉴定PMMoV（P1，2，3）抗性表现高抗。

1.2 马铃薯Y 病毒和辣椒轻斑驳病毒人工接种鉴定

PVY 和PMMoV 人工接种鉴定在法国农业科学院Benoit Moury 博士实验室进行，PVY 和PMMoV 接种鉴定方法分别参考Caranta 和Palloix（1996）及Kim 等（2008）的方法。PVY 鉴定株系为PVYson41（P1，2），PMMoV 鉴定株系为PMMoV（P1，2，3），每个材料接种30 株，接种15～20 d 后进行调查。

1.3 选育过程

自2005 年，分别以材料CM334（抗PVY，含Pvr4基因）和200375（抗PMMoV，含L4基因）为抗源，以甜椒自交系83-163（中抗疫病和CMV）为回交亲本，进行两两杂交。PVY 抗性鉴定利用Pvr4特异CAPS 标记（Pvr4-CAPS，Caranta et al.，1999）对回交后代分别进行单株选择；PMMoV 抗性鉴定利用人工接种的过敏性反应进行单株选择，对回交后代的园艺性状进行调查，保留园艺性状近于回交亲本83-163 的多个BC4抗病单株。然后将含有L4位点（83-163L4）和Pvr4位点（83-163Pvr4）BC4材料进行杂交，自交2 代，辅助分子标记选择（L4-SCAR，Kim et al.，2008；Pvr4-CAPS，Caranta et al.，1999），获得聚合L4和Pvr4位点的多个BC4F2单株（PT83-163BC4F2）。对每单株后代自交留种，利用标记筛选，最终确定抗性位点Pvr4和L4均纯合的株系（Pvr4Pvr4&L4L4），自交2 代后获得PT83-163BC4F4后代，对其进行性状观察和人工接种抗病性鉴定，详细转育过程如图2所示。

1.4 DNA 提取及分子标记辅助选择

植物基因组DNA 提取采用改良CTAB 方法（Saghai-Maroof et al.，1984）。利用L4基因特异标记L4-SCAR 对后代进行筛选，PCR 反应体系参考Kim 等（2008）的方法，扩增后PCR 产物利用2%琼脂糖凝胶电泳分离，电压为140 V，30 min。利用Pvr4基因特异标记Pvr4-CAPS 对后代Pvr4阳性株进行筛选，PCR 反应体系参考Caranta 等（1999）的方法，扩增后PCR 产物利用AlwNⅠ酶切过夜后，利用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测（抗病，444 bp；感病，458 bp），恒压160 V，2.5～3.0 h，快速银染法染色。

2 结果与分析

2.1 苗期人工接种鉴定200375 与83-163 后代的PMMoV 抗性

利用人工接种鉴定的方法筛选200375×83-163 后代中PMMoV 抗病单株（图3），接种后2 周内观察植株是否有过敏性反应出现。出现过敏性反应，表现抗病的单株保留，并继续回交。最终获得抗病单株BC4（83-163L4）。

2.2 分子标记辅助转育Pvr4 抗性基因

利用Pvr4特异分子标记Pvr4-CAPS 分别对83-163×CM334 的杂交及回交后代进行筛选，保留阳性单株并进行回交。图4 为BC4（83-163 ×CM334）群体部分单株筛选结果，63 株BC4后代中，26 株经AlwNⅠ酶切后获得了抗病特异条带（444 bp，单株泳道1、5、9、10、11、13、14、15、16、17、24、26、32、34、35、40、42、43、45、50、51、57、58、60、61、62），且带型均为杂合，阳性单株比例接近1∶1。

2.3 分子标记辅助选育聚合抗病基因L4 和Pvr4甜椒自交系PT83-163

利用抗病基因L4连锁标记L4-SCAR 和Pvr4连锁标记Pvr4-CAPS 筛选83-163Pvr4×83-163L4的杂 交BC4F1和BC4F2群体，保留L4和Pvr4基 因检测均为阳性的单株并进行自交。图5 为PT83-163BC4F1部分单株L4-SCAR 标记筛选结果，含有L4基因的单株可扩增出抗病特异条带（340 bp）。结果显示，46 株单株中，25 株经检测含有L4基因，抗性分离比例接近1∶1。

获得PT83-163BC4F2群体中聚合L4和Pvr4位点的多个阳性单株后，对每个单株分别自交留种。每个单株挑取30 株自交后代，利用标记L4-SCAR 和Pvr4-CAPS 进行筛选，保留后代中2 个抗性位点Pvr4和L4均纯合的株系（Pvr4Pvr4&L4L4），对该株系自交2 代，最终获得PT83-163BC4F4（Pvr4Pvr4&L4L4）后代。

2.4 甜椒自交系PT83-163 的PMMoV 和PVY 抗性人工接种鉴定

2013 年委托法国农业科学院对含有L4和Pvr4抗性位点的PT83-163BC4F4株系的后代进行PMMoV 和PVY 的人工接种抗病性鉴定。结果表明（表1），PT83-163BC4F4的后代对PVY（P1，2）和PMMoV（P1，2，3）均表现为抗病，83-163 和感病对照Yolo wonder 均表现感病。

表1 PT83-163BC4F5 人工接种抗病性鉴定结果

2.5 PT83-163 园艺性状表现

田间农艺性状调查发现，聚合L4和Pvr4位点的PT83-163BC4F4株系与原轮回亲本甜椒自交系83-163 的植株、叶、花、果等农艺性状均接近（图6），果实方灯笼形，4 心室，早熟，定植后25 d 商品成熟，果肉薄，青熟果绿色，老熟果红色，果面微皱，单果质量150 g。

3 结论与讨论

随着越来越多的基因被定位和克隆，分子标记开发技术的完善和标记类型的增多，分子标记辅助选择（marker assisted selection，MAS）在育种中的应用愈发广泛，特别是对于一些不能直接通过表型观察和田间鉴定的性状如产量、抗病性、抗逆性，以及多个性状的聚合，MAS 优势明显。如传统抗病育种很难实现多个抗性基因的聚合，费时费力，且存在鉴定结果重复性差、周期长等问题，MAS的应用可以大大提高育种效率，提高鉴定结果的准确性。目前在辣椒上已获得了大量与抗病基因紧密连锁的分子标记（Tai et al.，1999；Sugita et al.，2004；Kim et al.，2008；Kang et al.，2010；王立浩 等，2012；Liu et al.，2014；Sun et al.，2015），本试验利用L4位点连锁标记L4-SCAR 和Pvr4位点连锁标记Pvr4-CAPS 对后代进行选择，扩增条带稳定，分子标记选择结果与田间人工接种鉴定结果一致，结果准确，大大提高了育种的效率和准确性。因此，在今后工作中应更加注重分子标记与育种的结合。

病毒病一直是威胁辣椒生产的重要病害，常导致辣椒叶片坏死、枯斑、褪绿，植株矮化，落花、落果，对辣椒生产造成严重损失（秦蕾 等，2017；于海龙 等，2019）。其中烟草花叶病毒属病毒（Tobamovirus）一直是威胁辣椒生产的主要病毒，据报道该属中有13 种病毒能够侵染茄科作物并引起严重危害（Li et al.，2018）。PMMoV 近些年在我国多地辣椒产区被检测发现，主要分为P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4等3 种致病型（García-Luque et al.，1990；Velasco et al.，2002；Antignus et al.，2008）。目 前我国辣椒生产上PMMoV 致病型多以P1，2株系为主（张强 等，2014；李廷芳，2016），L3基因对烟草花叶病毒属病毒PMMoV（P1，2），P0（ToMV）和P1（paprika mild mottle virus，PaMMV）株系类型均具有抗性。本课题组在前期研究中已育成多个含有L3基因辣（甜）椒品种，在生产中的PMMoV抗性表现良好。L4基因对除P1，2，3，4致病型外的其余4 种致病型均具有广泛抗性，转育L4基因对于国内辣椒抗病育种具有重要的前瞻意义。本试验利用分子标记辅助选择结合回交育种，实现了聚合烟草花叶病毒属病毒抗性位点L4和PVY 抗性位点Pvr4的骨干自交系83-163 的种质创新，经人工接种鉴定PT83-163 对PMMoV 和PVY 均表现抗病，可用于下一步杂交组合的配制，为实现辣椒品种多个抗性基因的聚合提供了借鉴思路。