高效液相色谱-串联质谱法检测肉类原料中的药物多残留

沈春华 厦门古龙食品有限公司技术中心实验室 福建厦门 361000

肉类作为食品加工行业的一大类原料，随着食品安全问题备受社会日益关注的同时，肉类原料是否安全可靠，已引起了国内食品安全监管机构甚至国际食品法典委员会(CAC)的高度重视[1]。在畜禽养殖环节，为了预防和治疗畜禽的感染性疾病，给畜禽注射药物甚至添加到喂养的饲料中已成为了一个普遍的现象。而磺胺类(sulfonamides)和喹诺酮类(quinolones)作为广谱抗菌药由于具有高效、稳定、价格低廉等优点常常被大量运用。这就造成了畜禽肉类原料存在着兽药残留超标的风险。于是动物源性食品中的兽药残留引起了国内外的关注，控制兽药残留最主要的措施是加强监控和检测。我国对动物源性食品中，单个磺胺类药物或磺胺类药物总量的最大残留限量(MRL)为100 μg/kg[1],喹诺酮类的最高残留限量为10～400μg/kg[2]。

因此从源头上管控兽药残留是保证食品安全的一大措施。于是寻找高效、准确、快速地检测肉类原料中兽药残留的方法，成为了检测工作者不断努力的目标。目前，检测动物源性食品中喹诺酮类和磺胺类的方法主要有毛细管电泳法[3]、酶联免疫吸附测定法[4]、高效液相色谱法[5]以及液相色谱-串联质谱法[6]等。相比其它方法，高效液相色谱-串联质谱法灵敏度高，准确性好，并且能突破现行有效检测方法分类检测的局限，实现多种类兽药残留的高通量检测。

本研究运用高效液相色谱-串联质谱技术建立了一个快速、简便的方法，这个方法能同时检测肉类原料中磺胺类(磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲异噁唑、磺胺甲基异噁唑、磺胺嘧啶)和喹诺酮类(恩诺沙星)8种药物的残留量。此方法的灵敏度和精密度等参数，均能满足实验室质量控制规范中检测方法确认的技术要求。

1 材料与方法

1.1 样品和试剂

实验用样品采用的是冻猪肉原料，由厦门古龙食品有限公司提供。

7种磺胺类标准品(磺胺二甲嘧啶sulfamethazine、磺胺间二甲氧嘧啶sulfadimethoxine、磺胺间甲氧嘧啶sulfamonomethoxine、磺胺甲基异噁唑sulfamethoxazole、磺胺嘧啶sulfadiazine、磺胺二甲异噁唑sulfisoxazole、磺胺甲氧哒嗪sulfamethoxypyridazine)和1种喹诺酮类标准品(恩诺沙星enrofloxacin)，纯度均大于99%，德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司。

主要试剂：乙腈、甲酸、正己烷均为色谱纯，购置于上海安谱实验科技有限公司；无水硫酸钠为分析纯，购置于西陇化工股份有限公司；实验用水为一级水。

1.2 仪器设备

1.2.1 LC-MS/MS联用设备

高效液相色谱仪Agilent1200，美国安捷伦公司；

串联质谱仪API4000，配有电喷雾离子源，美国应用生物系统公司。

1.2.2 其它仪器设备

其它仪器设备详见表1。

表1 其他仪器设备一览表

1.3 分析方法步骤

1.3.1 样品的预处理

将肉类样品用搅拌机搅拌均匀，用样品袋装好，贴上标签，置于冰箱待测。

1.3.2 样品处理

准确称取1g肉类样品于50mL具塞离心管中，加入10mL 1%甲酸-乙腈，3g无水硫酸钠，均质30s，旋涡振荡后8 000r/min离心5min,将上清液转移至20mL试管中，离心管再加入5mL 1%甲酸-乙腈，重复提取一次，合并提取液，在45℃下用氮气吹干，加入1mL(乙腈∶0.1%甲酸水=2∶8)旋涡振荡溶解残渣，用2mL正己烷脱脂2次，以15 000r/min离心3min，吸取下层清液经0.2μm有机滤膜过滤，转移至样品瓶中，待HPLC-MS/MS测定。

1.3.3 基质混合标准工作液配制

称取适量阴性样品若干份，置于50mL具塞离心管中，按上述1.3.2方法的步骤操作，制成基质溶液。

精确称取适量各个药物标准品，用甲醇溶解，配成浓度均为100μg/mL的标准储备溶液，-18℃冰箱避光保存。分别准确吸取适量上述储备液，置于同一容量瓶中，用甲醇逐级稀释成浓度均为0.1μg/mL的混合标准工作液，4℃下避光保存。再准确吸取10、50、100、250、500、1 000μL混合标准液分别置于10mL的试管中，在45℃下用氮气吹干，吹干后再准确加入1mL上述制备的基质溶液，配制成1、5、10、25、50、100μg/L基质标准工作液，现用现配。

1.3.4 回收率和精密度实验

准确称取若干份空白阴性肉类样品于50mL具塞离心管中，分别添加不同浓度的标准溶液旋涡混合，放置过夜，使标准品在肉类样品中实现充分的混合从而达到交换平衡，然后按上述1.3.2方法的步骤提取、净化与测定。设置5、10、50μg/kg 3个浓度添加水平计算回收率，每个添加水平进行6次平行实验，计算出相对标准偏差(RSD)。

1.3.5 液相色谱/串联质谱条件

液相色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(5μm 4.6×150mm)；流速0.8mL/min；柱温35℃;进样量5μL。梯度洗脱程序详见表2。

表2 液相色谱梯度洗脱条件

串联质谱条件：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测(MRM)；电喷雾电压IS5000V；离子源温度TEM450℃；碰撞气CAD(N2)，6；气帘气CUR(N2)，30；GS1，55；GS2，55；驻留时间为50ms；入口电压EP10V；监测离子对、DP和CE详见表3。

表3 质谱参数

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化

本试验采用乙腈、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈3种溶剂作为提取剂，对提取效果进行比较，结果表明1%甲酸乙腈的提取率最高，此结果与有关报道一致[7]。

磺胺类和喹诺酮类化合物在酸化条件下溶解度比较大，使用酸化乙腈提取可提高提取率，因此本方法选用1%甲酸乙腈作为提取剂。由于肉类原料都含有一定量的水分，所以实验过程中添加无水硫酸钠以去除基质中的水分，利于氮吹浓缩，同时硫酸钠的存在可使蛋白质的变性进一步的分散，防止样品凝结成块状影响目标物的提取，从而提高回收率。

肉类原料还含有大量的脂肪，提取液中仍存在部分的脂类物质，而这8种药物均不溶于正己烷，故采用正己烷除去脂类物质，达到进一步净化提取液的效果。

2.2 质谱条件的优化

分别准确称取8种药物的标准品，用甲醇溶解，配制成200mg/L的标准溶液，再用(甲醇∶0.1%甲酸水=1∶1)稀释配制成1mg/L的混合标准溶液。

通过进样泵以20μL的流速进1mg/L的混标，来优化各个单标的离子对和其它质谱条件。

先通过Q1扫描，确定化合物的母离子并优化母离子的去簇电压DP。再通过MS2扫描，找出各个化合物的待选子离子。

最后通过MRM扫描优化其碰撞能量CE，使得母离子与子离子组成的离子对强度达到最大时为最佳，选择响应值较高、干扰较小的两对子离子为定性离子，响应值最高的作为定量离子(优化后的质谱参数见表3)。

图1为8种药物在优化条件下的MRM色谱图。

图1 8种药物的MRM色谱图

2.3 标准曲线和定量限

为了消除基质效应，减小实验误差，本研究采用1.3.3的方法配制基质混合标准工作液。以定量离子峰面积和对应的浓度(μg/L)进行线性回归分析，所用的8种标准物质在1～100μg/L范围内线性良好。相关系数为0.9956～0.9998，均大于现行有效的国家标准GB/T 27404-2008中检测方法确认对校准曲线的技术要求0.99[8]。以10倍信噪比计算8种药物的定量限，如表4所示，均低于或等于国标方法GB/T 20759-2006和GB/T 21312-2007中规定的定量限[9,10]。

表4 方法精密度(n=6)和加标回收实验结果

2.4 回收率和精密度

按1.3.4的方法进行回收率和精密度试验，结果见表4。在5μg/kg的添加水平下，回收率为75.4%～102%，相对标准偏差为1.8%～9.1%；在10μg/kg的添加水平下，回收率为67.8%～101%，相对标准偏差为1.2%～7.9%；在50μg/kg的添加水平下，回收率为79.4%～115%，相对标准偏差为2.1%～6.5%。均符合实验室质量控制规范GB/T 27404-2008中对回收率和精密度的技术要求[8]。

3 总结

本研究应用HPLC-MS/MS法检测肉类原料中的两类8种兽药残留，采用基于正离子扫描的MRM监测模式，用保留时间和离子对定性，响应值高的碎片离子作为定量离子，基质匹配外标法定量。结果表明，所测定的目标物分离良好，重现性好，操作步骤简便、快捷。磺胺类兽药残留的定量限最低可达1μg/kg，喹诺酮类的恩诺沙星的定量限为3μg/kg，完全能满足目前国内外对肉类原料中相应药物最大残留量的要求。所涉8种药物在1～100μg/L范围内线性良好，相关系数为0.9956～0.9998，在低、中、高3个添加水平下，加标回收率为67.8%～115%，相对标准偏差为1.2%～9.1%，表明该方法具有良好的准确性和精密度，在实际应用中，检测效果良好，分析时间较短，可用于肉类原料中多种兽药残留的快捷高通量检测。