基于MeDIP-seq 研究蛋氨酸对巨噬细胞炎症中甲基化水平的影响

徐翌斌，罗成龙，瞿 浩，计 坚，舒鼎铭

（畜禽育种国家重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东省农业科学院动物科学研究所，广东广州 510640）

蛋氨酸（Methionine，Met）作为家禽玉米-豆粕型日粮的第一限制性氨基酸，也是动物体内的必需氨基酸，对提高家禽的免疫功能、生长性能和抗氧化性等方面至关重要[1]。当日粮缺乏Met 时，肉鸡会出现食欲减退、生长缓慢和免疫功能缺陷等症状[2]。Li 等[3]研究表明，Met 不仅能参与免疫分子（细胞因子、抗体、补体等）的合成，同时介导了免疫组织和器官的正常发育。同时，Met 可通过提高机体内血清溶菌酶活性、外周淋巴细胞活性和和白细胞的吞噬活性[4]，积极参与调节机体的固有免疫和体液免疫[5-6]。

Met 是机体内重要的甲基供体之一，参与众多的DNA 甲基化过程[7]。DNA 甲基化在转录水平上调控基因的表达，高甲基化状态会导致基因表达抑制，而低甲基化状态会促进基因表达。Wichnieski 等[8]研究发现，DNA 甲基化与动物机体炎症和衰老等众多生理疾病密切相关。用甲基化方式调控炎症因子或炎症信号通路的表达可以缓解炎症反应[9]。Arroyo-Jousse 等[10]研究表明半胱氨酸可提高TNF-α启动子区高甲基化水平从而缓解炎症反应。本课题组前期发现Met 能缓解脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞炎症反应[11]，但其分子调控机制尚不明确。因此，本研究从甲基化角度初步探究DNA甲基化与Met 抑制LPS 诱导巨噬细胞炎症中调控机制的相关性，进而为Met 调控免疫功能提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及试验相关试剂 本试验的小鼠巨噬细胞所用RAW264.7 细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC细胞库）。Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素/ 链霉素抗生素购自Gibco 公司。蛋氨酸、脂多糖、二甲基亚砜购自Sigma公司。磷酸缓冲溶液购自上海生工生物公司。

1.2 巨噬细胞处理 将细胞铺板至6 孔板中，接种密度为1×106个/mL，细胞置于细胞培养箱中过夜培养。设置空白（Ctr）组、LPS 组和Met+LPS 组，每组3 个重复。Ctr 组细胞为正常培养基细胞（不添加LPS 和Met），LPS 组细胞为正常培养基培养后添加100 ng/mL 的LPS刺激3 h，Met+LPS 组细胞为含10 mmol/L 的Met 培养基培养12 h 后，用100 ng/mL 的LPS 刺激3 h。

1.3 全基因组甲基化测序 收集各组处理后的巨噬细胞（共3 组，每组3 个重复）放置干冰，委托安诺优达基因科技有限公司完成MeDIP-seq。操作步骤：提取并纯化巨噬细胞全基因组 DNA；将基因组 DNA 打断至100～500 bp；对全基因组 DNA 片段末端进行修复，在3'端加腺嘌呤，并连接测序接头，双链 DNA 单链化；采用 5-甲基胞嘧啶抗体对测序接头DNA 进行沉淀富集；Q-PCR 扩增后跑胶，切胶纯化并质控产物；合格文库用于上机测序。

1.4 全基因组甲基化测序的生物信息学分析 对下机数据序列进行去污染和去低质量处理，将筛选后的reads 与参考基因组（mm10）进行定位对比并统计信息，每条read最多允许3 个碱基错配。基于MACS 软件对全基因组处理后的序列进行甲基化峰（peak）扫描，得到每组样品的peak 区域信息结果，并统计在基因元件（upstream2k、5'UTR、CDS、Intron、3'UTR、downstream2k）上的分布，并进行对比分析。根据差异的read 数量，将差异的基因分为高甲基化基因和低甲基化基因。例如，样品1 vs.样品2，同一个peak 区域内样品2 的reads 数量高于样品1 的基因为高甲基化基因，反之为低甲基化基因（筛选条件：P＜0.01，两样本在相同基因元件内都有覆盖，且覆盖度的差异在2 倍以上），并统计在基因组不同区域上差异甲基化基因的分布。最后，将两样品间的差异基因进行GO 功能富集分析和KEGG 功能分析。

2 结果与分析

2.1 全基因组测序数据处理 如表1 所示，在Ctr 组、LPS组 和LPS+Met 组分别得到177 730 085、176 089 330、163 741 744 个比对reads 数和151 460 128、151 069 422、140 320 769 个唯一比对reads 数，比对率达分别达53.04 %、56.38 %和54.04 %，唯一比对率分别达45.2 %、48.37 %和46.31 %，并且LPS 组的比对率和唯一比对率均高于Ctr 组，而LPS+Met 组的比对率和唯一比对率均低于LPS 组。

表1 MeDIP-seq 数据统计结果

2.2 统计MeDIP-Seq 的甲基化峰（Peak）信息 基于MACS 软件对各组细胞的MeDIP-seq 数据进行peak 扫描并统计信息。如表2 所示，LPS 组的peak 数量、总长度和覆盖率均高于Ctr 组，而LPS+Met 组的peak 数量、总长度和覆盖比例均低于LPS 组。

表2 Ctr 组、LPS 组和LPS+Met 组中peak 区域信息统计结果

2.3 统计富集区域在基因不同区域上的分布 运用MACS 软件定位peak 的位置相关信息，对peak 位置进行基因功能分类（upstream2k：转录上游2 000 bp 区；5'UTR：5' 端非翻译区；CDS：编码序列区；Intron：内含子区；3'UTR：3'端非翻译区；downstream2k：转录下游2 000 bp 区）。如图1 所示，多数的peak 分布在Intron 区（约51%）。

2.4 统计两组间差异甲基化基因数 根据差异的reads数量，将差异的基因分为高甲基化基因和低甲基化基因，并定位到基因元件上。如图2 可见，在Ctr 组和LPS 组不同基因元件上共鉴定出217 个低甲基化基因和506 个高甲基化基因，其中在LPS 组每个不同基因功能元件上高甲基化基因数都多于低甲基化基因数。而在LPS组和LPS+Met 组共鉴定出459 个低甲基化基因和122个高甲基化基因，其中在LPS+Met 组每个不同基因功能元件上高甲基化基因数都低于低甲基化基因数。

2.5 差异甲基化基因的GO 富集分析 基于本课题组前期研究发现，Met 能够缓解LPS 诱导的细胞炎症反应[11]。以下研究重点分析LPS 组和LPS+Met 组中巨噬细胞差异甲基化基因。如图3 所示，GO 富集分析包括生物学进程、分子功能和细胞成分3 大类。生物学进程中主要富集在单一生物过程（Single-Organism Process）和细胞过程（Cellular Process），细胞成分主要富集在细胞（Cell）和细胞部分（Cell Part），分子功能主要富集在结合（Binding）上。生物进程上共富集有419 个高甲基化基因和1 576 个低甲基化基因，有517 个高甲基化基因和397 个低甲基化基因富集在分子功能，有1 277 个高甲基化基因和3 129 个低甲基化基因富集细胞组成。在3 大类GO 富集功能上总的低甲基化基因数（3 129 个）明显多于总高甲基化基因（862 个）。

图1 Ctr 组、LPS 组和LPS+Met 组中peak在不同基因功能元件上的分布Ctr vs LPS

图2 基于不同基因元件上Ctr 组、LPS 组和LPS+Met 组间差异甲基化基因的分布

2.6 差异甲基化基因的KEGG 功能分析 KEGG Pathway是分析peak 区域相关基因所涉及到的细胞信号通路，选择基因富集最显著的20 个通路来进行分析。如图4 所示，Q 值越小，甲基化基因富集越显著，其中最富集的通路是Hippo 信号通路（Hippo Signaling Pathway），随后是细胞粘附分子（Cell Adhesion Molecules）、谷氨酸能突触（Glutamatergic Synapse）、轴突传导（Axon Guidance）、肌动蛋白细胞骨架调控（Regulation of Actin Cytoskeleton）、磷酸肌醇代谢（Inositol Phosphate Metabolism）等通路。

3 讨 论

Met 作为家禽第一限制性氨基酸，又是动物机体内重要的甲基供体之一，在DNA 转移酶（Dnmts）的作用下参与DNA 甲基化，在调控动物机体免疫功能等方面发挥重要作用。本课题组前期研究发现Met 能缓解LPS 诱导的巨噬细胞炎症反应[11]，但其分子调控机制尚不明确。首先，本研究利用MeDIP-seq 技术分析Met 影响巨噬细胞炎症中全基因组DNA 甲基化变化特征，其次，确定差异甲基化基因与生物学功能之间的关系，并初步探究Met 抑炎的分子机制。本研究结果表明，Met 能缓解LPS 诱导巨噬细胞的高甲基化水平，差异甲基化基因主要富集在Hippo 信号通路。

图3 LPS 组与 LPS+Met 组的差异甲基化基因GO 富集结果

图4 LPS 组与 LPS+Met 组的差异甲基化基因KEGG 富集散点图

MeDIP-seq 是基于抗体富集原理进行全基因组甲基化测序的一种高通量测序技术，可以统计整个基因组DNA 甲基化谱的分布，并能够高效率地检测出全基因组中甲基化差异的区域，是目前比较不同细胞、组织或疾病个体样本间的全基因组DNA 甲基化差异的检测技术[12]。本研究测序结果表明，Ctr 组、LPS 组和LPS+Met 组分别 产生了177 730 085、176 089 330、163 741 744 个唯一比对read 数，在此基础上利用MACS软件进一步分别鉴定出160 467、169 253、163 576 个甲基化峰（peak）区域，大多数的peak 定位在基因Intron 区，分析发现LPS 组中鉴定出的peak 数量和覆盖比例均大于Ctr 组，而Met+LPS 组的peak 数量和覆盖比例均小于LPS 组。结果表明LPS 组的甲基化程度高于Ctr 组，Met+LPS 组的甲基化程度低于LPS 组，添加Met 后能够缓解LPS 诱导的巨噬细胞炎症高甲基化水平。

根据peak 内read 数量在不同基因功能元件上挖掘分析各组间的差异甲基化基因。分析结果发现，相较于Ctr 组，LPS 组每个不同基因功能元件上的高甲基化基因数均多于低甲基化基因数，而相较于LPS 组，LPS+Met 组每个不同基因功能元件上的高甲基化基因数均低于低甲基化基因数。此结果进一步证实甲基供体Met 的补充能够缓解LPS 诱导的巨噬细胞中基因组高甲基化水平，这与前期研究结果一致。Osorio 等[13]发现饲喂添加Met 饲料的荷斯坦奶牛中全基因组DNA甲基化水平程度较低。Yang 等[14]发现在饲粮中添加Met 的小鼠中FABP4启动子区甲基化水平有所降低。另外一项相关研究也发现，给母体或断奶后小鼠补充叶酸（甲基供体）饲养，其全基因组DNA 甲基化程度降低[15]。导致这一类现象的原因或许与DNA 甲基化转移酶的表达有关。动物机体内Dnmts 分为Dnmt1、Dnmt2 和Dnmt3 3 类，其 中Dnmt3 包 括3 个亚类：Dnmt3a、Dnmt3b 和Dnmt3l。Dnmt1 是维持甲基化转移酶，Dnmt2 的甲基转移酶活性尚不明确，Dnmt3a 和Dnmt3b 是从头合成甲基化转移酶，Dnmt3l 缺乏甲基化酶活性，但可以与Dnmt3a 和Dnmt3b 相互作用[16-18]。Li 等[19]研究发现，补充叶酸能通过下调Dnmt1和Dnmt3a的表达而诱导高脂饲粮小鼠中肥胖相关基因低甲基化。另外，Kohno 等[20]研究发现Dnmt3a在动物体内调控能量代谢稳态方面发挥重大作用。Dnmt1和Dnmt3b基因可介导炎症反应中炎症基因的表达[21-23]。探索各类甲基转移酶在Met 介导DNA 甲基化调控炎症反应的影响值得进一步深入研究。

本研究通过GO 富集和KEGG 对LPS 组与Met+LPS组之间的差异甲基化基因进行分析。GO 富集分析发现在生物学过程（Biological Process）中差异甲基化基因主要富集在单一生物过程（Single-Organism Process）和细胞过程（Cellular Process）。GO 富集的每个生物学分类上的高甲基化基因数均少于低甲基化基因数，进一步证实Met 能够降低LPS 诱导的巨噬细胞中基因组高甲基化水平。通过KEGG 分析发现，甲基化基因主要富集在Hippo 信号通路上。Hippo 信号通路最早发现于果蝇研究中，主要是调控细胞的生长，组织器官的大小以及抑制癌症等[24]。同时，Zhou 等[25]研究表明Hippo 信号通路在调节免疫功能和维持免疫稳态方面发挥重大作用。在抑制果蝇的Hippo 信号通路情况下，果蝇会更容易被革兰氏阳性菌感染，致死率提高[26]。Wang 等[27]研究表明不同的血流模式可通过调控内皮细胞的Hippo 信号通路来抑制炎症并缓解动脉粥样硬化的形成。IL-4/IL-13 诱导M2 巨噬细胞极化和LPS/IFN-γ诱导的M1 巨噬细胞极化可以通过Hippo 信号来调节[28]。抑制Hippo 信号通路，能增强LPS/TLR4 介导NF-κB 信号通路的活化，增加促炎因子IL-6 和TNF-α的表达[29]。Hippo 通路还参与肿瘤免疫反应，其关键蛋白Yap 活化有助于肿瘤细胞逃脱免疫系统的清除[30]。

4 结 论

本研究运用MeDIP-seq 技术发现，Met 能缓解LPS 诱导的巨噬细胞DNA 高甲基化水平，差异甲基化基因主要富集在Hippo 信号通路。通过本研究分析有助于初步理解Met 抑炎的分子调控机制，在畜禽生产中为Met 调控机体免疫功能提供一定的理论基础。