外泌体miRNA 在配子发育和受精中的调控作用

陈慧芳，杨镁楹，吴志胜，张守全，白银山*

（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231；2.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642）

外泌体（Exosomes，EXs）是由细胞释放的直径在30～100 nm 的细胞外囊泡，携带大量的RNAs、蛋白质和脂质等生物活性物质，其中miRNA 的含量最丰富，是细胞间信息交流的主要分子[1]。细胞外囊泡除了EXs外，还包括膜微粒、微囊泡和凋亡小体，它们的直径超过100 nm，有些可以达到2 μm，成为区别EXs 的主要标志[2]。研究显示，EXs 大量存在于卵泡液、精液、唾液、血浆、乳汁、汗液和尿液等体液中，广泛参与动物机体生命活动和物质代谢调控[3-4]。EXs 通过胞膜内陷、融合的方式形成磷脂双分子层膜包裹的囊泡体，膜上结合组织特异性蛋白，普遍包括跨膜蛋白超家族（CD9、CD63 和CD81 等）、热休克蛋白家族、浮舰蛋白-1、葡萄糖新陈代谢酶、信号转导蛋白、融合蛋白以及翻译延伸因子等，这些蛋白成为了识别和鉴定EXs 的分子标志[5-7]，EXs 通过与受体细胞黏附、融合和被内吞等方式进入细胞内，完成物质的运输[8]。

研究显示卵泡液、附睾液和副性腺液内中含有丰富的EXs，这些EXs 携带大量的miRNA 分子[10-13]，其中一些miRNA 的数量和种类的改变会导致配子发育停滞、精卵受精障碍和各种生殖系统疾病产生，显示了EXs携带的miRNA 在配子发育和生殖器官功能维持中的重要作用[14]。目前，不同物种生殖器官来源的EXs 的形态、大小、数量及更多潜在的生物学机制仍然不清楚[15-17]。本文将重点综述卵泡液、附睾液和副性腺液内中EXs的来源及其携带的miRNA 在卵母细胞发育、精子成熟和受精过程中的调控作用，为治疗人类不孕不育症和提高畜禽繁殖力等方面的研究提供参考。

1 外泌体的研究历史

早在1978 年，Ronquist 等[18]发现前列腺膜状结构的小囊泡，称为前列腺小体，是最早被检测到与生殖相关的小囊泡；1980 年，Jones 等[19]和Davis[20]分别在猪和兔的精子膜上发现膜状结构的小囊泡，但在当时却被认为是由于固定不当引起的假象；1985 年，研究发现仓鼠附睾头部的精子膜表面附有30～100 nm 的小囊泡，并仅附于顶体区域，附睾尾精子顶体膜上的小囊泡数量却显著减少，当时把这类小囊泡定义为附睾小体[21]。随后，在仓鼠[22]、小鼠[23]、牛[24]、羊[25-26]和人类[27]精子中均被证实存在附睾小体，并推断附睾小体可以将生物调节物质运输到精子顶体表面，与精子成熟加工有关[28]，后来在副性腺和雌性动物生殖道内也鉴定出了大量小囊泡。1983 年，Johnstone 等[29]首次在绵羊网织红细胞中，证实了纳米级细胞外囊泡的存在，并命名为EXs；直到2007 年，Valadi 等[30]才鉴定出EXs 中富含生物活性调节物质，其中miRNA 含量最丰富。miRNA 作为基因表达调控的重要分子，在生命活动和生理过程中发挥重要调控作用。

2 外泌体miRNA 在卵母细胞发育中的调控作用

在雌性动物卵泡内，卵泡液EXs 主要来源于颗粒细胞、壁细胞和卵母细胞，通过递送分泌的蛋白质和miRNA 等生物活性物质，建立细胞间的联系，构成了卵母细胞和颗粒细胞生存的微环境[31]，促使卵泡发育有规律的进行和完成[32-34]。Machtinger 等[17]研究显示，EXs 携带大量miRNA 介导关键基因和信号通路的调控，调节颗粒细胞增殖凋亡、激素合成、卵母细胞减数分裂和成熟等，促进卵泡发育。

人类卵泡液中EXs 携带的miR-99、miR-100、miR-218、miR-212、miR-214、miR-29a 和miR-132参与了卵母细胞减数分裂和成熟发育的调控过程[14]；与人血浆中EXs 携带的miRNA 相比，miR-218、miR-503 和miR-654-3p 在卵泡液中是特异性表达的，另外还有10 个miRNA 表达水平比较高，这些miRNA 对Wnt 通路、丝裂原活化蛋白激酶、表皮生长因子受体和转化生长因子β信号通路等进行调控，促进了卵母细胞发育[35]；在牛生长期和成熟期卵泡液EXs 中均富含miR-654-5p、miR-640 和miR-373 3 个miRNAs，它 们在卵母细胞成熟和物质代谢中发挥重要调控作用[36-37]。卵泡液中miR-23a 通过抑制ERK1/2 信号通路，调控SIRT1蛋白表达，促使颗粒细胞凋亡，调节卵泡闭锁[38]；miR-143 可以调控大量的细胞周期基因，抑制颗粒细胞增殖和促进卵泡闭锁[39]；miR-320a 靶向颗粒细胞E2f1/Sf-1基因，抑制颗粒细胞增殖和雌二醇的产生，促进孕酮的合成[40]；在体外培养山羊卵巢颗粒细胞时，发现当添加山羊卵泡液EXs 时，能显著促进颗粒细胞的增殖[41]；卵泡液中EXs 携带miRNA 参与调控颗粒细胞类固醇激素代谢相关的关键基因，miR-17-5p 和miR-20a 可以调节DMRT1 表达水平、miR-138、miR-338 和miR-200a调节CYP17A2的表达水平及miR-456 和miR-138 调控AMH的表达水平，完成了颗粒细胞激素的生成和卵泡发育[42-43]。

EXs 携带的miRNA 表达水平与年龄也具有相关性[44]。研究发现老龄马卵泡液中miR-181A、miR-375和miR-513a-3p 的表达水平明显高于性成熟小马，这些miRNA 被卵母细胞摄取后，可以抑制卵母细胞中TGF-β 信号通路，导致卵泡发育受阻[45]；对比38 岁以上和31 岁以下的女性卵泡液EXs 中miRNA 的表达水平，发 现miR-21-5p、miR-99b-3p、miR-134 和miR-190b 等4 个miRNA 表达存在显著差异，它们涉及细胞外基质受体表达调控、p53 信号通路等的调控、肝素硫酸盐和碳水化合物的合成及代谢等促使卵泡提前发育和闭锁[46]，这些研究均表明了雌生殖道内的卵泡液中EXs 所携带的miRNA 在卵母细胞发育、代谢、颗粒细胞增殖和激素分泌等过程中的重要作用（表1）。

3 外泌体miRNA 对精子发育的调控作用

雄性动物生殖系统中EXs 来源于睾丸、附睾和副性腺等多个组织，根据在生殖道内的不同位置分别命名为附睾小体（Epididymosome）和前列腺小体（Prostasome）[6]。而精液中的EXs 主要来源于睾丸、附睾和副性腺器官分泌的液体混合物，即精浆外泌体（seminal plasma EXs，spEXs）。睾丸和附睾分泌的液体约占精液总体积的60%，前列腺分泌的液体约占30%，其他副性腺约占10%，这些EXs 携带的生物活性调节分子（研究最多的是miRNA）参与精子发生、修饰加工及受精能力的调控（图1）。精子进入附睾时不具备受精能力，经历附睾头向附睾尾的运输过程，使精子的形态结构和生理特征发生一系列的改变，并逐步走向成熟，再经过雌性动物阴道、子宫及输卵管后抵达受精部位，与卵母细胞相遇、穿过放射冠、透明带和卵黄膜等，引发顶体反应和卵黄膜反应，最终受精完成[47]，在这个过程中精子也受到来自雌性动物生殖道内EXs的大量修饰和调控，显示了EXs 携带的miRNA 在这一系列过程中参与调控精子加工和受精的重要作用。

表1 雌生殖道内的卵泡液外泌体miRNA

3.1 睾丸来源的外泌体miRNA 在精子发生中的调控作用 雄性生殖干细胞是位于曲细精管基底膜上具有维持自我更新和不断产生精子过程的干细胞。支持细胞（Sertoli Cells，SCs）是生精小管内的另外一类细胞，参与生殖干细胞的自我更新和精子分化的调节，为精子发生提供物质保障和结构支持[48]。关于SCs 释放EXs对精子发育调节的研究目前还并不清楚，精子发生的调控机制将进一步研究完善和丰富。

3.2 附睾小体miRNA 在精子成熟发育中的调控作用附睾是精子运输、成熟和贮存的重要场所，由附睾头、附睾体和附睾尾3 个部分组成[49]。附睾内精子基因表达呈高度的区域化，表明精子在附睾内运输过程中不断被加工和修饰，研究显示附睾不同位置细胞分泌的EXs携带miRNA 数量和种类存在很大差异[50]。牛附睾小体测序中，发现附睾液EXs 中的miR-143、miR-214、miR-145，miR-202 和miR-199 等分布在附睾头部；miR-1224、miR-395 和miR-654 多分布于尾部，miR-18a、miR-1826、miR-662 和miR-3936 分布于附睾体；而miR-449 在附睾头和附睾尾部均高水平表达，这些附睾小体携带miRNA促进了精子的代谢和活力的维持[51]。小鼠附睾小体测序中，检测到附睾液EXs 中含有358个miRNA，其中miR-10b-5p、miR-10a-5p、miR-143-3p、miR-141-3p 和miR-30a-5p 在附睾中特异性表达，涉及建立精子表观遗传学修饰，miR-375、miR-467a、miR-467d 和miR-467e 分布于附睾头部；发现miR-34b、miR-34c、miR-139 和miR-196 分布于附睾尾部，而miR-34c 和miR-467e 主要分布于附睾尾和附睾头部，涉及精子活力和代谢调控[52]。在人类和非人类灵长类动物附睾中特异表达的miR-888 簇均分布在附睾头和附睾尾部[53]，涉及调节精子成熟和精子运动的能力[52]。也有研究发现附睾小体中miR-26a-5p 和let-7g-5p 等具有抗凋亡作用，与精子活力调控密切相关[54]，这些附睾小体中miRNA 具体的功能还有待进一步阐释，但目前的研究显示了附睾小体内所含miRNA 可以广泛参与调控精子成熟和精子的运动能力等。此外，附睾小体携带的巨噬细胞移动抑制因子（MIF）和多元醇途径中的醛糖还原酶等进入精子后，MIF 与外致密纤维进行结合，参与锌鳌合及二硫键的形成；多元醇途径中的醛糖还原酶则通过介导精子糖脂类能量物质代谢来促进精子活力的维持[4]。成熟精子内基因组高度甲基化，基因的转录数量显著减少，显示附睾小体携带大量的miRNA，是否均能被精子摄入、是否能够在精子体内结合到功能基因而发挥调控作用等问题仍未获知，这些摄入的miRNA 是否可以在精子体内积累，并通过EXs 方式释放，并且在受精过程中发挥作用等还有待进一步研究。

3.3 副性腺来源的EXs 的miRNA 在精子代谢中的调控作用 副性腺分泌的液体是组成精液的一部分，主要包括前列腺、精囊腺和尿道球腺分泌的液体，其中前列腺分泌的液体比较多，所以其中含有调控性EXs 所占比例也较高，是组成spEXs 的一部分。目前，副性腺EXs 主要集中在前列腺的研究中，可能是因为尿道球腺和精囊腺等分泌的液体较少，制约了EXs 的检测与分析，随着EXs 检测技术的提高，未来可能会有更多的研究发现（图1）。前列腺小体对精子活力的维持和物质代谢调控也是不可或缺的。研究显示miR-34c-5p、miR-122、miR-513a-5p 和miR-509-5p 在前列腺小体中高水平表达，具有促进精子成熟、防止过早获能等重要作用[55]；前列腺小体中除了携带大量的miRNA，还携带一些重要的调节性蛋白和营养物质[55]，可以促使精子膜受体处于开放状态，增加Ca2+的内流[56]；对副性腺来源的EXs 携带的其他生物活性物质是否还具有更多的潜在功能还有待进一步解析。

3.4 精浆外泌体miRNA 在精子发育中的调控作用 精液组成的成分可以有效防止精子过早发生顶体反应，保护精子抗氧化损伤和精子质膜的完整性以及免受雌性免疫系统的侵袭等，其中spEXs 也发挥着重要作用。

Du 等[57]报道猪spEXs 对维持精子活力、精子膜完整性、抗氧化能力和抑制不成熟精子获能等具有重要的调控作用；与原精液相比，添加EXs 稀释剂提高了精子抗氧化能力，降低了丙二醛含量，延长了体外保存精子的时间[58]。也有研究显示spEXs 介导精子多肽磷酸化的降解，可以抑制依赖性获能的胆固醇外流，调控精子受精能力[59]，在性别可反转的半滑舌鳎鱼spEXs测序时，发现dre-miR-141-3p、dre-miR-10d-5p、ssamiR-27b-3p 和ssa-miR-23a-3p 4 个miRNA 表达水平与雌雄发育有关[60]。此外，研究证明spEXs 可以递送调节蛋白（如富含半胱氨酸的分泌蛋白1）到精子膜表面，保护精子[61]。spEXs 来源于附睾和睾丸的数量最多，其中miRNA 的研究数据还很少，因为精子基因表达数量很少，miRNA 是否能够参与精子基因表达调控还并不清楚[62]，对于畜牧业大生产上采用稀释精液和深度输精的方式是否可有效避免spEXs 稀释而造成受精过程的影响等，还缺乏相关证据。spEXs 是否能够参与调控雌性生殖道细胞，促进精子获能和保护精子等并不清楚，目前spEXs 携带miRNA 的研究主要集中在改善人的生殖能力或治疗精子病理学等相关的研究。

4 外泌体miRNA 对精子受精的调控作用

精子受精过程是一个极其复杂的调控过程，包括在雌性动物生殖道内EXs 的调控作用，如阴道小体（Vaginosome）、子宫小体（Uterosome）和输卵管小体（Oviductosome）等，实现了对精子不同程度的加工和修饰，也保护了精子免受伤害，获得受精能力[62-63]。很多动物精子储存在雌性动物生殖道内，生殖道细胞来源的EXs 在精子受精能力维持中发挥了重要作用[47]。Griffiths 等[59]研究发现，子宫小体携带精子受精必需的跨膜蛋白和糖基磷脂酰肌醇连接蛋白（SPAM1），增强精子穿越卵丘细胞的能力。输卵管小体携带透明带相关的特异性糖蛋白质膜Ca2+-ATP 酶4（PMCA4）到精子表面，增加对抗透明带水解的能力，硬化透明带，减少多精子受精，提高精子活力和防止精子过早获能[64]。这些证据显示了雌性动物生殖道内EXs 参与调控精子受精能力的作用，目前相关研究还缺乏EXs miRNA 的数据。

5 外泌体miRNA 与生殖性疾病

生殖器官细胞EXs 携带的miRNA 异常表达会引起严重的生殖系统疾病[40,55]（图2）。多囊卵巢综合征（PCOS）患者卵泡液中存在6 种差异性表达的miRNA，其中高表达的miR-199 抑制CYP19A1的表达[65]，促进了POCS 的发生发展；还有研究显示POCS 患者卵泡液中的miR-125b/19b/222[31]、miR-1293/551a[66]和miR-16-5p/15b/486-5p/4646-5 等上调表达，miR-24-3p/29a/151-3p 等下调表达[67]；此外，也有研究发现miR-16-5p/15b/486-5p/4646-5p 表达异常[39]会引起排卵障碍。

在男性生殖系统疾病（无精子症[68]、弱精子症[68-69]、少精子症[69]、非阻塞无精子症[70-71]和精索静脉曲张不育症[72]）患者中，也伴随spEXs 的miRNA 表达异常的现象（图2），但这些miRNA 的相关调控机制研究还很少，主要集中在测序阶段的弱精子症患者中，精浆miR-101-3p/let-7b-5p 表达水平降低，而过表达miR-151a-5p 靶向Cytb生产，减少精子细胞的呼吸和ATP水平，降低精子活力[67,69]；精索静脉曲张患者精浆中miR-122/181a/34c-5p 表达水平显著降低，涉及参与精子活力、形态、精液谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、精液凋亡标记物BCL2 等的调控[72]，这些研究揭示了生殖系统疾病miRNA 的异常表达，其中潜在机制还并没有解析清楚，深入研究生物活性调节分子miRNA 介导的发病机制和调控作用，有望成为疾病诊断和治疗的靶标。

6 展 望

EXs 已成为生殖领域的研究热点，参与配子发育和受精过程的调控，完善和丰富了生殖生理的调控机制，但许多EXs 相关的功能还并不清楚，需要进一步研究。在人类生殖系统疾病中显示EXs 携带的miRNA 存在表达异常，这些miRNA 可能成为治疗靶点和分子诊断标记，具有潜在的应用前景。此外，建立标志性的EXs miRNA 与畜禽繁殖力相关联，在提高畜禽繁殖力方面有着重要的临床意义，生殖系统EXs 研究将成为人类生殖医学研究和家畜繁殖育种及筛选的新方向。