CD81、CCL26 基因在黔北麻羊不同性腺组织中的表达研究

惠茂茂，周志楠，敖 叶，唐 文，洪 磊，陈 祥*

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025）

黔北麻羊是贵州三大地方山羊品种之一[1]，属短毛皮肉兼用品种，具有适应性强、繁殖率高、产肉性能良好等优点[2]。四跨膜蛋白超家族（TM4ST）是一组分子量在20～50 ku 的细胞膜蛋白[3]。CD81S属于四跨膜蛋白超家族，是细胞内外信号传递的重要桥梁。根据自身具有的黏附效应，CD81在卵母细胞发育过程中发挥至关重要的作用。聂青和[4]研究发现在不同孕期胎盘绒毛组织中CD81基因的表达量不相同。据相关研究发现，CD81基因参与卵泡发育及排卵的调控过程[5]。此外，CD81基因也在大脑发育[6]、神经视网膜细胞的介导[7]、丙型肝炎病毒（HCV）感染[8]等方面也发挥相当大的作用。

趋化因子是一类目前为止数量最多、具有趋化吸引性的蛋白分子，在肿瘤的发展和转移有着重要作用[9]。CCL26基因是趋化因子中的一类，在嗜酸性粒细胞表面表达量最高[10-11]。有研究表明，趋化因子CCL26基因与结肠癌的转移有重要关联[12]。趋化因子对妊娠也影响甚大。在子宫内膜被侵入滋养细胞过程中趋化因子可促血管生成因子，直接影响胎盘发育[13]。目前CCL26基因与动物繁殖性能的相关研究较少。本实验旨在探究趋化因子对动物性腺细胞的直接或间接影响表达，以单、多羔黔北麻羊为研究对象，通过检测CD81、CCL26基因在组织中的差异表达量，为进一步探讨2 个基因对山羊繁殖的影响提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由贵州省习水县富兴畜牧业开发有限公司提供6 只健康单、多羔黔北麻羊母羊，进行屠宰后分别采取下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢5 个部分性腺组织，液氮保存运回实验室备用。

1.2 实验试剂 TRIzol@Reagent 试剂盒购自贵州绿盟英创生物科技有限公司；荧光定量试剂q-PCR Mix 购自擎科生物科技有限公司；逆转录试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 移液枪：德国Eppendprf 公司；紫外可见分光光度计，购自美国Thermo Fisher 有限公司；电泳仪（DYY-2C 型），购自北京市六一仪器厂；PCR 扩增仪（C1000 TouchTM）、实时荧光定量PCR 仪（型号为CFX96 Real-Time System）、凝胶成像系统（Universal Hood Ⅱ），均购自美国BIO-RAD 有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 引物设计 根据GenBank 公布的山羊CD81基因序列（登录号： NM_001285676.1）；CCL26基因序列（登录号：XM_005697796.3）利用Primer Premier 5.0 软件进行引物设计，将β-actin作为内参基因。设计引物后交上海生工生物工程技术服务股份有限公司合成。引物基本信息见表1。

表1 黔北麻羊CD81、CCL26 引物信息

1.4.2 RNA 的提取 根据TRIzol@Reagent 试剂盒说明书分别提取下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢5 个组织中RNA。并用超微量分光光度计测定其浓度和纯度，将峰图单一、曲线平滑、OD260/OD280比值在1.8～2.0 的RNA 保存于-80℃冰箱，用于后续逆转录实验。

1.4.3 cDNA 的合成 采用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒将提取的RNA 逆转录合成cDNA 第一链。反转录体系的体积为20 μL：dNTP mix（2.5 mmol/L Each） 4 μL，Primer mix 2 μL，RNA 模板2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT（0.1 mol/L） 2 μL，HiFi Script 1 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL。PCR 反应条 件为42℃孵育50 min，85℃孵育5 min 于-20℃冰箱保存。

1.4.4 实时荧光定量q-PCR 10 μL 反应体系：cDNA 模板1 μL，SYBR Premix Ex Taq TM 酶（2×）5.5 μL，上、下游引物（10μmol/μL）各0.5 μL，ddH2O 2.5 μL。q-PCR程序：95℃预变性 1 min，95℃变性15 s，退火15 s，60℃延伸32 s，39 个循环，熔解曲线由机器自动设置，每个实验设计3 个重复并设置阴性对照。

1.4.5 统计分析利用2-ΔΔCt相对定量法[14]计算目的基因的相对表达量。使用SPSS 23.0 软件中One-Way ANOVA 进行单因素方差分析，使用LSD 法进行差异显著性检验，试验结果采用平均值± 标准差来表示，P＜0.05 为差异显著性判断标准，以P＜0.01 作为差异极显著性的判断标准。

2 结果

2.1CD81、CCL26基因的扩增黔北麻羊CD81、CCL26基因扩增结果如图1 所示。经过PCR 扩增，CD81基因大小为129 bp，CCL26基因大小为167 bp。与预测片段大小一致，且条带清晰、单一，无非特异性扩增，证明目的基因CD81、CCL26荧光定量引物特异性良好，可做下一步实验研究。

图1 CD81（A）、CCL26（B）基因扩增图像

2.2CD81、CCL26基因在黔北麻羊单、多羔不同性腺中表达分析

2.2.1CD81基因在黔北麻羊单、多羔不同组织的表达分析 如图2 所示，CD81基因在黔北麻羊单、多羔5 个组织中均有不同程度表达。在单羔组内，CD81基因在卵巢中的表达量最高，其次为输卵管、垂体、下丘脑，在子宫中的表达量最低；在卵巢中的表达量极显著高于其他组织；垂体、输卵管表达量极显著高于下丘脑、子宫。在多羔组内，CD81基因在卵巢中的表达量最高，其次为垂体、子宫、输卵管，在下丘脑中的表达量最低；卵巢表达量极显著高于其他组织；垂体与输卵管、下丘脑表达量差异极显著。CD81基因mRNA 在子宫多羔组中的表达量显著高于单羔组，其余组间无显著差异。

图2 CD81 基因在黔北麻羊单、多羔不同组织中的表达

2.2.2CCL26基因在黔北麻羊、多单羔不同组织的表达分析 如图3 所示，CCL26基因在黔北麻羊单、多羔不同组织的表达量各不同。单、多羔组均在卵巢组织表达量最高，下丘脑表达量最低；单羔中各组织的表达量普遍高于多羔。单羔组内，CCL26基因在卵巢、输卵管和子宫的表达量极显著高于下丘脑和垂体表达量。多羔组内，CCL26基因在卵巢、输卵管组织表达量极显著高于下丘脑、垂体、子宫，在垂体、下丘脑、子宫间差异不显著。CCL26基因在单羔组子宫的表达量极显著高于多羔组；在单羔组输卵管和卵巢的表达量显著高于多羔组。

3 讨 论

图3 CCL26 基因在黔北麻羊单、多羔不同组织中的表达

3.1 各组织中CD81基因表达量的变化情况CD81是机体内分布广泛、参与各种生理应答的跨膜蛋白分子，在信号转导、抗原呈递、细胞融合等机制中发挥重要作用，目前对于这一基因的研究越来越广泛[15]。有研究证明慢性肝病的发生是由于丙型肝炎病毒（HCV）感染导致的，其中CD81基因直接或间接参与了整个病毒感染机制的发生[16]。Rubinstein 等[17]研究发现，在小鼠卵母细胞表面，CD81基因与富含跨膜蛋白的膜相关联，缺乏CD81基因会导致小鼠雌性的生育能力缺陷。汤继顺等[18]对小尾寒羊和苏尼特羊进行实验时发现，CD81基因在14 种组织中均有高表达，小尾寒羊性腺组织中下丘脑表达量最高，苏尼特羊卵巢表达量最高，在精卵质膜融合过程中起重要作用。何柳等[19]实验发现，CD81基因除了在性腺组织中高表达外，还在以猕猴为模型的肝脏、脾脏淋巴结等组织中显著表达。Ohnami 等[20]通过小鼠免疫细胞化学分析表明，CD81广泛分布在卵母细胞细胞膜外，参与精子卵母细胞的融合。Jankovicova 等[21]在比较猪和牛卵母细胞中CD81的定位过程中发现，此基因在卵母细胞成熟和胚胎早期发育过程能够高度表达。本实验发现，CD81基因在黔北麻羊单多羔中都有表达，CD81基因在单多羔卵巢组织表达量最高，且均极显著高于其他组织，这与相关实验结果[17-18,20]一致。据相关研究证明，CD81基因的过表达可提高小鼠的受精率[22]。因此可以推断，山羊的繁殖力与CD81基因有着重要关联，尤其是卵巢组织中。CD81基因参与山羊精卵融合相关的机制推测还需进一步证实。

3.2 各组织中CCL26基因表达量的变化情况CCL26作为嗜酸性粒细胞趋化因子，通过CCR3受体发出信号[23]，而CCR3除了在嗜酸性粒细胞表达外，还在绒毛滋养细胞、合胞体滋养细胞和EVT 等表达[24]。由此猜测CCL26对于滋养层细胞有作用。Chau Simon 等[25]证明了CCL26在子宫中高表达，调节子宫蜕膜螺旋小动脉的重塑过程，影响妊娠过程。Dominguez 等[26]从原代上皮子宫内膜细胞收集的条件培养基中发现CCL26的存在，表达量极高。

EoE 患者的活检物中CCL26表达显着增加，并且单核苷酸多态性与疾病发病率增加相关[27]。Caselli 等[28]在女性原发特异性不孕的实验中发现子宫内膜细胞上CCL26基因表达量升高。还有实验证明CCL26基因在发情周期的第0、3、7 天在子宫内膜中表达且第0天表达量最高[29]。本实验发现，在黔北麻羊性腺组织中CCL26的表达量不同，在卵巢中表达量最高，下丘脑表达量最低，垂体、子宫、卵巢表达量居中。目前CCL26基因引发炎症反应的研究居多，而在性腺组织的相关性研究较少，尤其是在动物为模型的相关实验。本实验CCL26基因子宫也在山羊中高表达，与Chau Simon 等[25]、Dominguez 等[26]研究结果一致。通过CCL26在性腺组织中的表达量高低推测CCL26可能调控山羊的繁殖，但具体机理有待进一步研究。

4 结 论

通过对黔北麻羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢5 个组织CD81和CCL26基因的荧光定量分析，表明2 种基因在山羊单多羔中都有不同表达，在卵巢中表达量最高；CD81在单羔下丘脑组织、双羔下丘脑组织表达量最低，CCL26在单多羔下丘脑组织表达量最低。CCL26基因在单羔组子宫的表达量极显著高于多羔组。结果证明2 种基因可能影响性腺发育，参与山羊繁殖调控，为进一步研究基因功能提供依据。