一测多评法结合指纹图谱在枳壳质量评价中的应用

卢焘韬，王雪莲，穆成林，唐丽婧，周 欣，张 琳，曲 彤，康 希，杨荣平, , *

一测多评法结合指纹图谱在枳壳质量评价中的应用

卢焘韬1，王雪莲1，穆成林1，唐丽婧1，周 欣1，张 琳2，曲 彤3，康 希2，杨荣平1, 2, 3*

1. 西南大学药学院, 重庆 400715 2. 成都中医药大学药学院, 四川 成都 611137 3. 陕西中医药大学药学院, 陕西 西安 712046

基于一测多评（QAMS）与指纹图谱的方法建立27批枳壳的质量评价方法。以柚皮苷为参照，计算芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的相对校正因子，并测定其含量，比较外标法与QAMS法的差异性。采用HPLC法，建立27批枳壳饮片的指纹图谱，通过聚类分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）对指纹图谱进行评价。QAMS法与外标法测量值之间无显著性差异；建立枳壳饮片指纹图谱方法，相似度均＞0.95，共标定11个共有峰，通过与对照品谱图比对，确定了3号峰为芸香柚皮苷、4号峰为柚皮苷、5号峰为橙皮苷、6号峰为新橙皮苷。QAMS法结合指纹图谱可为评价枳壳饮片的质量提供参考。

枳壳饮片；一测多评；指纹图谱；聚类分析；芸香柚皮苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷；主成分分析

枳壳为芸香科植物酸橙L.及其栽培变种的干燥未成熟果实[1]，枳壳之名始载于《雷公炮炙论》[2]，在此之前枳壳一直以枳实之名载于《神农本草经》[3]。枳壳具有理气宽中、行滞消胀的功效。其味苦、辛、酸，性微寒，归脾、胃经。用于治疗胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂。枳壳主要含有挥发油类、黄酮类和生物碱类等化学成分[4]。黄酮类化合物是枳壳具有理气、行滞、祛痰作用的重要化学成分，主要为橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷等。现代研究表明，黄酮类化合物主要在抗氧化、抗炎、抗癌抑菌等方面发挥作用[5-7]。

目前对于枳壳的研究还停留在对其单一成分进行质量控制，然而中药多成分的复杂性决定了单一成分无法全面控制枳壳药材的质量[8-9]。王智民等[10]提出一测多评法（quantitative analysis of multi- components by single-marker，QAMS）通过药材有效成分间存在的内在函数和比例关系，可测定一个成分的含量进而实现多个成分的同步测定。基于此，本研究通过建立QAMS的方法达到以主要成分作为指标来进行全面质量控制；同时采用HPLC法建立枳壳的指纹图谱，并进行相似度评价、聚类分析和主成分分析[11-12]，以期为枳壳的质量评价提供技术手段和科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HY-04型超高速中药粉碎机（巩义市予华仪器有限责任公司）；CPA-225D型电子天平（万分之一、十万分之一，德国Sartorius公司）；SCQ®-G2016数控加热超声波清洗机（上海声彦超声波仪器有限公司）；予华HH恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪（四元泵、DAD检测器，美国Thermo-fisher公司）。

1.2 试药

对照品芸香柚皮苷（批号111530-201715，质量分数≥96.8%）、柚皮苷（批号110722-201815，质量分数≥91.7%）、橙皮苷（批号110721-201818，质量分数≥96.2%）、新橙皮苷（批号111857-201707，质量分数≥92.5%）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国TEDIA公司）；水为自制超纯水；其他试剂均为分析纯。枳壳饮片共27批样品，经重庆市中药研究院李隆云教授鉴定为芸香科植物酸橙L. 及其栽培变种的干燥未成熟果实枳壳净制润制切制等后的加工品，样品信息见表1。

2 QAMS法

2.1 内参物的选择

柚皮苷作为枳壳的成分之一，在药材中含量较高且从色谱图分离效果良好，因此选择柚皮苷作为内参物。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（18∶82）等度洗脱，体积流量为1.0 mL/min，检测波长 283 nm，进样量10 μL，柱温25 ℃，上述色谱条件下，对照品及枳壳供试品溶液色谱图见图1。

1-芸香柚皮苷 2-柚皮苷 3-橙皮苷 4-新橙皮苷

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成含芸香柚皮苷0.32 mg/mL、柚皮苷1.06 mg/mL、橙皮苷0.20 mg/mL、新橙皮苷1.01 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 称取枳壳饮片粉末0.5 g，精密称定，置100 mL 圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1.5 h（75 ℃），放冷，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液经0.22 μm滤膜滤过，即得。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.1、0.5、1、2、3、4、5 mL，加甲醇稀释制得系列混合对照品溶液。按“2.2.1”项下方法，精密吸取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以各对照品质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（）绘制标准曲线，得回归方程、线性范围、相关系数，见表2。

2.2.5 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD分别为1.56%、0.10%、1.21%、0.10%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批枳壳供试品（S1），按“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD分别为1.02%、0.56%、2.11%、0.13%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一批枳壳供试品（S1），按“2.2.3”项下方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、20、24 h测定，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD分别为1.08%、0.54%、1.64%、0.54%，表明供试液在24 h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取样品（S1）0.25 g，共6份，分别加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件测定含量，计算加样回收率，结果芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的加样回收率分别为99.72%、100.45%、99.79%、100.20%，RSD值分别为2.57%、1.65%、1.88%、1.20%，表明加样回收率符合要求。

2.3 相对校正因子 (fk/s) 的计算

以柚皮苷为内参物，按照公式k/s＝(S×A)/(k×S)（式中k为待测组分对照品的浓度，A为待测组分对照品的峰面积，S为内参物浓度，S为内标物峰面积）。因此，QAMS法可在外标法测得一个成分（标准物）的基础上，测定样品中其他成分C的浓度（或含量），按照公式C＝(S×k)/(k/s×S)计算，即得。取“2.2.2”项下的混合对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10、20 μL测定，计算柚皮苷对芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的f/s，结果见表3。进一步对f/s重现性考察。

2.3.1 色谱柱及高效液相色谱仪的考察 在不同实验室条件下，分别考察Ecosil HPLC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3种不同厂家色谱柱，以及UltiMate 3000高效液相色谱仪，Agilent 1290液相色谱仪和岛津LC-20A型高效液相色谱仪对f/s及待测峰相对保留时间的影响，结果见表4。结果表明不同色谱柱、不同仪器以及不同实验室实验条件下，柚皮苷对芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的f/s分别为0.954、1.159、1.223，RSD值均小于5%，表明本方法重现性，耐用性良好。

2.3.2 待测组分色谱峰的定位考察 内参物柚皮苷通过对照品定位，其他待测组分采用相对柚皮苷的保留时间（retention time，RT值）进行定位。采用QAMS法进行测定时，通过柚皮苷的保留时间计算其他待测组分峰的相对保留时间（relative retention time，RRT），根据RRT值及光谱吸收可对其他3个组分进行准确定位。本实验测定了相对保留值在不同仪器、不同色谱柱上的重现性，结果见表5。可见，各待测组分与柚皮苷的相对保留时间RSD均＜5%，表明利用RRT进行色谱峰的定位是可行的。

2.4 QAMS法与外标法结果的比较研究

按照“2.2.3”项下方法制备27批饮片供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进样。先用外标法对枳壳样品中4种不同成分进行测定，再用QAMS法建立待测成分间的f/s对其他成分的质量分数进行计算，各批次每个样品测定3次，取平均值，对外标法和QAMS法检测结果进行比较，结果见表6。常规的外标法实测含量值与QAMS法计算的含量经检验，结果表明，2种方法所得枳壳饮片含量不存在显著性差异，且2种方法所得含量值的相对误差都在3%以内，由此说明QAMS法用于枳壳饮片的多成分质量评价研究是可行的。

3 枳壳HPLC指纹图谱的建立

3.1 色谱条件

色谱柱：Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.1%的磷酸（B），梯度洗脱（0～35 min，30%～50% A；35～45 min，50%～70% A；45～50 min，70%～75% A；50～70 min，75%～100% A）。体积流量1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长330 nm，进样体积10 μL。

3.2 对照品溶液的制备

分别取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成含芸香柚皮苷0.05 mg/mL、柚皮苷0.7 mg/mL、橙皮苷0.04 mg/mL、新橙皮苷0.5 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

3.3 供试品溶液的制备

供试品溶液制备同“2.2.3”项下方法。

3.4 精密度试验

取“3.1.2”项下对照品10 μL，按“3.1.1”项下色谱条件连续进样6次，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD分别为1.23%、1.06%、1.94%、1.82%，表明仪器精密度良好。

3.5 重复性试验

取同一批枳壳供试品（S1），按“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“3.1.1”项下色谱条件测定，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD分别为1.70%、1.14%、1.00%、0.21%，表明该方法重复性良好。

3.6 稳定性试验

取同一批枳壳供试品（S1），按“2.2.3”项下方法制备，按“3.1.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、20、24 h测定，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积的RSD分别为1.99%、1.55%、1.76%、1.83%。

3.7 枳壳饮片指纹图谱的建立及共有峰的鉴定

按“2.2.3”项下方法制备27批枳壳供试品溶液，按“3.1.1”项下色谱条件测定，得到27批枳壳饮片样品HPLC指纹图谱，见图2。将其全部导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件》（2012版），设定S1为参照图谱，采用中位数法生成共有模式图，共确定11个共有色谱峰，见图3。通过与对照品图谱对照，指认其中4个色谱峰，即峰3为芸香柚皮苷，峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为新橙皮苷。

3.8 共有峰的相对峰面积

以峰4为对照峰（S），计算其他10个共有峰的相对峰面积，结果见表7。

3.9 指纹图谱相似度评价

以27批样品指纹图谱共有模式为对照，计算各批次样品相似度，结果见表8。S9、S15、S16、S20、S22、S23、S24、S26的相似度分别为0.956、0.963、0.989、0.973、0.989、0.979、0.956、0.988，S25的相似度为0.974，S21的相似度为0.950，其余批号相似度均大于0.990。

3.10 聚类分析（CA）

以11个共有峰峰面积为变量，导入SPSS20.0软件，选择平方欧式距离为测度进行CA，结果见图4。当分类距离为5时，可分为4类，S1～8、S10～14、S17～19、S27聚为一类，S9、S15、S16、S20、S22～24、S26聚为一类，S25聚为一类，S21聚为一类。聚类趋势与相似度评价基本一致。

3.11 主成分分析（PCA）

PCA是在尽可能保持原有数据信息的前提下，通过降维处理达到简化指标的目的。本实验将27批样品的11个共有峰峰面积导入SPSS20.0软件，计算相关系数矩阵、特征值和方差贡献率，进行PCA分析，并将特征值大于1的成分提取出来，得到数个主成分，结果见表9、10。由表9可知，前3个主成分特征值大于1，对方差的累积贡献率为88.801%，因此枳壳饮片的多个成分可以简化为3个主成分进行分析。

载荷的绝对值越大，对主成分的贡献越大。由表10可知，峰8、9、10、11、4在主成分1上有较高的载荷，峰7、6、2在主成分2上有较高的载荷，峰5、3在主成分3上有较高的载荷，绝对值大于0.7。参照对照品谱图，可以知道峰3为芸香柚皮苷，峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为新橙皮苷。

表9 特征值与贡献率

4 讨论

本实验分别考察了样品溶液的提取方法（加热回流和超声）、提取溶媒（纯甲醇、乙醇、80%甲醇）、溶媒用量（100、150、200倍）和提取时间（1、1.5、2 h），在保证既节约成本、有效利用，又操作简单的条件下，最终确定以甲醇50 mL（100倍）回流提取1.5 h作为供试品的制备方法。色谱条件考察了流动相种类（甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水等）和等度洗脱的流动相比例（16∶84、18∶82、19∶81），实验发现以乙腈-0.1%磷酸水为流动相，18∶82等度洗脱时出峰多，峰形好且分离度高，因此选择此系统为更优的色谱条件。

目前，QAMS法已在多种中药材、饮片以及中药制剂的多成分的含量测定中得到广泛认可和应用[13]，《中国药典》2015年版中就已收录用QAMS法对黄连、丹参等中药进行含量测定[14]。本研究利用枳壳黄酮类化合物结构的相似性，建立了QAMS法用于枳壳饮片中的4种成分的初步测定。研究选择的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷成分在枳壳药材中含量较大，具有一定的生物活性，可以反映药材的内在质量。其中柚皮苷化学性质稳定，作为内参物，具有一定的代表性。通过比较本法和外标法，相对误差的结果表明所建立的枳壳“一测多评”含量测定方法与外标法的测定结果无显著性差异，表明建立的方法具有良好的可信度。同时研究考察了不同高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子的影响，验证了QAMS法在枳壳质量控制中的准确性和可行性。本研究可以为枳壳饮片多指标质量控制模式提供新方法，为修订枳壳饮片的质量标准和评价提供参考依据。

枳壳中含有多种化学成分，测定一个或几个指标成分往往具有局限性，不能充分反映其质量。因此建立全面系统的特征性指纹图谱是评价和控制质量的有效方法。通过化学计量法（CA、PCA）的分析，表明枳壳饮片具有明显分类趋势。通过相似度分析、CA、PCA模式识别等分析方法结果相互印证，对所收集到的27批枳壳饮片进行分类并筛选出共有的特征成分和影响其质量关键的色谱峰，为枳壳饮片鉴别和质量控制提供依据。

综上，本研究以芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷4种成分为指标建立QAMS法测定枳壳含量的同时，建立枳壳的HPLC指纹图谱将定性的指纹图谱与定量的QAMS结合起来。其操作简便、结果准确、重复性好、专属性强，可以为枳壳的质量评价等研究提供依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Application of fingerprint combined with QAMS in quality evaluation of

LU Tao-tao1,WANG Xue-lian1,MU Cheng-lin1,TANG Li-jing1,ZHOU Xin1,ZHANG Lin2,QV Tong3,KANG Xi2,YANG Rong-ping1, 2, 3

1. College of Pharmacy, Southwest University, Chongqing 400715,China 2. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. College of Pharmacy, Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, China

To establish the quality evaluation method of 27 batches ofbased on QAMS and the fingerprint.Taking naringin as the reference, the relative correction factors of narirutin, hesperidin, and neohesperidin were calculated. The contents were determined and the differences between the external standard method and QAMS method were compared. And the fingerprints of 27 batches of decoction pieces ofwere established by HPLC, and evaluated by cluster analysis(CA) and principal component analysis (PCA).There was no significant difference between the measured values of QAMS method and external standard method. The method of fingerprint of decoction pieces ofwas established, the similarities were greater than 0.95. There were 11 common peaks in the HPLC fingerprint, compared with the control product spectrogram, peak 3 was narirutin, peak 4 was naringin, peak 5 was hesperidin, peak 6 was neohesperidin.The QAMS method combined with fingerprint can provide a reference for evaluating the quality of decoction pieces of.

decoction pieces of; QAMS; fingerprints; cluster analysis; narirutin; naringin; hesperidin; neohesperidin; principal component analysis

R286.2

A

0253 - 2670(2021)02 - 0558 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.030

2020-08-09

国家中医药管理局中药标准化项目（ZYBZH-Y-CQ-46）

卢焘韬（1996—），女，硕士在读，研究方向为中药新制剂、新剂型及新技术的研究与应用。Tel: 17623409186 E-mail: 502351917@qq.com

杨荣平，女，博士，研究员，硕士生导师，从事中药新制剂、新剂型及新技术的研究与应用。Tel: (023)89029056 E-mail: yangrp@cqacmm.com

[责任编辑 时圣明]