葛根素联合阿仑膦酸钠对绝经后骨质疏松大鼠氧化应激、炎症反应及骨代谢的影响

陈文明 胡芯源

萍乡市人民医院脊柱外科，江西 萍乡 337000

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)指绝经后女性卵巢功能衰退，雌激素分泌水平下降，骨代谢失衡，导致骨量减少，骨强度下降，骨结构退变，骨脆性增加为特征的一种代谢性骨骼疾病[1]。氧化应激和炎症反应影响骨细胞的分化、增殖、凋亡，参与骨重建过程和PMOP发生和发展[2]。葛根素(puerarin，Pue)属于植物雌激素，可以产生雌激素样活性，具有促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞分化，改善骨代谢，增加骨量，增加骨密度，减少骨吸收，促进骨形成作用[3-4]。本研究通过观察葛根素联合阿仑膦酸钠对绝经后骨质疏松大鼠氧化应激、炎症因子和骨代谢的影响，探索其潜在的作用机制，为中西医结合防治PMPO的临床应用提供理论依据和新思路。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与材料

雌性Wistar大鼠52只，12周龄，未孕，体重230～260 g，由赣南医学院提供，许可证号：SCXK(赣)2014-0001。葛根素注射液(规格：100 mg/支，国药准字：H20053739，安康北医大制药股份有限公司)，阿仑膦酸钠片(福善美)(70 mg/片，国药准字：J20040004，美国默沙东制药有限公司)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、转化生长因子-β(TGF-β)、白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)、I型胶原羧基末端肽(ICIP)购于武汉华美生物工程有限公司，Lunari DXA型双能X射线骨密度检测仪购于美国GE公司。

1.2 方法

1.2.1构建骨质疏松大鼠动物模型：采用“双侧卵巢摘除术”构建绝经后骨质疏松大鼠动物模型[5]。假手术组不切除卵巢，仅在卵巢周围切除等量脂肪组织，其他操作步骤相同。所有大鼠均饲养于山东中医药大学动物实验室，同等饲养条件：1～2只/笼，恒温恒湿，人工明暗交替光照，自由饮食水，活动，标准大鼠饲料喂养。

1.2.2分组及药物处理：造模成功评价标准：造模8周后骨密度(BMD)峰值减少≥2.5 SD(标准差)。SD大鼠造模成功45只，造模成功率约86%。实验分为假手术组、去卵巢组、A药组、B药组、AB药组。确认造模成功后第2天给予药物干预，对照组和去势组：(0.9% Nacl 5 mL/kg/，ih，1次/d)，药物A组(葛根素 35 mg/kg，ih，1次/d)，药物B组(福善美 0.5 mg/kg，po，1次/d)，药物AB组(葛根素 35 mg/kg，ih，1次/d+福善美 0.5 mg/kg，po，1次/d)，连续给药6周。

1.2.3标本取材：药物干预6周结束后，水合氯醛腹腔注射麻醉，股动脉取血，4 ℃，3 000 r/min，离心5 min，分离血清，-20 ℃保存。解剖双下肢股骨，0.9% Nacl冲洗，4%多聚甲醛固定24 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脱钙14 d，骨形态学改变观察。

1.2.4检测血清氧化应激指标、炎性因子和骨代谢指标：取出上清液，采用ELISA法检测各组血清氧化应激指标：MDA、CAT、SOD、GSH，炎性因子指标：TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-1，骨代谢指标：ALP、BGP、TRAP-5b、ICIP。所有操作严格参照各试剂盒说明书进行操作。

1.2.5检测骨组织骨密度：取大鼠L5椎体和右侧股骨，在LunariDXA型双能X线吸收扫描仪扫测，采用小物体Discovery Wi扫描模式，用仪器选定兴趣区，以2.0 mm×2.0 mm为中心区域，软件分析计算BMD值。

1.2.6HE染色法观察骨组织形态学：参照HE染色法操作步骤，制作石蜡切片，脱蜡去水，苏木素染色，1%盐酸分化，脱水透明，封片，显微镜观察染色效果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠血清氧化应激指标比较

去卵巢组大鼠血清SOD和GSH-Px水平较假手术组均显著降低(P<0.05)，A药组、B药组、AB药组血清水平较去卵巢组均显著升高(P<0.05)，以AB药组最高。去卵巢组大鼠血清H2O2和MDA水平较假手术组均显著升高(P<0.05)，A药组、B药组、AB药组血清水平较去卵巢组均显著降低(P<0.05)，以AB药组最低。见表1。

表1 各组大鼠血清氧化应激指标比较Table 1 Comparison of serum oxidative stress indicators of rats between each group

2.2 各组大鼠血清细胞因子指标比较

去卵巢组大鼠血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1水平较假手术组均显著升高(P<0.05)，A药组、B药组、AB药组血清水平较去卵巢组均显著下降(P<0.05)，以AB药组最低。见表2。

表2 各组大鼠血清细胞因子指标比较Table 2 Comparison of serum cytokine indexes of rats among various groups

2.3 各组大鼠血清骨代谢指标

去卵巢组大鼠血清ALP、BGP、TRAP-5b、ICIP水平较假手术组均显著升高(P<0.05)，A药组、B药组、AB药组血清水平较去卵巢组均显著下降(P<0.05)，以AB药组降低。见表3。

表3 各组大鼠血清骨形成生化指标比较Table 3 Comparison of biochemical indicators of serum bone formation between each group of rats

2.4 各组大鼠骨组织骨密度比较

去卵巢组大鼠腰椎和股骨BMD较假手术组显著降低(P<0.05)，A药组、B药组、AB药组骨组织BMD较去卵巢组均显著升高(P<0.05)，以AB药组最高。见表4。

2.5 各组大鼠股骨骨形态学改变

假手术组骨皮质正常，骨板层结构整齐，骨小梁数较多，排列有序；去卵巢组呈骨质疏松样改变，骨皮质明显变薄，骨板层结构不整齐，骨小梁明显稀疏，排列紊乱，髓腔明显扩大；A药组和B药组骨皮质松质骨改变，骨小梁较前增多，小梁稍细但排列尚规则，间距稍宽，髓腔较前变小。AB药组骨皮质松质骨轻微改变，骨小梁明显增多，排列规则，间距变窄，连续性、完整性较好，髓腔明显变小。见图1。

表4 各组大鼠骨组织BMD比较

图1 各组大鼠股骨形态结构变化(×40)A：假手术组；B去卵巢组；C：A药组；D：B药组；E：AB药组Fig.1 Morphological changes of the femur in each group (× 40)A: Sham operation group; B Ovariectomy group; C: Drug group A; D: Drug group B; E: AB drug group

3 讨论

雌激素水平下降被认为导致PMOP的主要机制，然而补充雌激素骨质疏松症并未得到明显改善，单一将雌激素缺乏作为骨质疏松的发病机制不够完善[6]。研究发现氧化应激和炎性细胞因子参与PMOP的发生、发展，雌激素对骨质疏松的防治作用可能与其全身抗氧化、抗炎作用有关[7]。雌激素的分泌减少、活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加、炎性因子分泌增加是PMOP的重要原因[8]。葛根素作为天然植物葛根中提取分离出的一种单体异黄酮类化合物，对骨产生类雌激素样作用，可改善骨代谢；而且还能增加骨密度和骨矿含量，改善骨生物力学性能[9]。阿仑膦酸钠作为第3代二膦酸盐(BPs)类药物，可抑制骨吸收、降低骨转换、预防骨量丢失和减少骨折发生[10]。

绝经后雌激素缺乏机体内积累过多的ROS通过调控多种细胞因子、酶活性和受体配体的表达，促进成骨细胞的凋亡和破骨细胞的增殖及分化，使骨形成小于骨吸收，骨重建失衡[11]。本研究结果显示绝经后骨质疏松大鼠血清SOD和GSH-Px显著降低，H2O2和MDA水平均显著升高，氧化应激反应参与PMOP的发生发展过程，而葛根素联合阿仑膦酸钠能够显著减少脂质过氧化代谢产物H2O2和MDA的表达，增加抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，最终减轻氧化应激诱导的损伤。初步表明葛根素联合阿仑膦酸钠通过抑制氧化应激反应发挥对骨质疏松的改善作用。葛根素具有清除成骨细胞氧自由基、活性氧，发挥抗氧化作用，促进骨细胞增殖、分化和矿化功能[12]。葛根素能提高机体SOD和GSH-Px活性，降低H2O2和MDA含量，保护机体免受氧化应激损伤[13]。

绝经后雌激素水平降低可通过介导一系列细胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α、TGF)等的分泌增多，促进破骨细胞增殖和增强活性，参与骨重建，打破骨形成与骨吸收的动态平衡，导致PMOP[14]。本研究发现绝经后骨质疏松大鼠血清TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-1被大量释放，说明炎性反应在PMOP的发生发展中发挥重要作用。葛根素联合阿仑膦酸钠能够降低血清TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1水平，有效抑制炎性反应；初步表明葛根素联合阿仑膦酸钠对骨质疏松症的改善作用，伴随炎性反应改变。罗琳等[15]研究发现葛根素联合阿仑膦酸钠降低绝经后骨质疏松症患者血清骨代谢指标(BALP、BGP、TRAP-5b)和免疫因子(IL-10、IL-6、TNF-α)水平。

骨代谢主要由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成构成，骨代谢可及时反映机体内骨转换状态，骨代谢、骨重建的变化[16]。本研究显示葛根素联合阿仑膦酸钠抑制氧化应激和炎性反应，调节血清骨代谢ALP、BGP、TRAP-5b、ICIP等指标，从而提高腰椎和股骨BMD，改善骨组织形态学结构，发挥抗骨质疏松作用。有研究发现葛根素联合阿仑膦酸钠通过减轻老年骨质疏松患者炎症反应和氧化应激，改善骨质代谢，增加骨密度，临床治疗效果显著[17]。

综上所述，本研究初步表明葛根素联合阿仑膦酸钠具有协同抑制减轻绝经后骨质疏松大鼠氧化应激和炎症反应，降低氧化应激和炎性因子分泌，调节骨代谢，改善骨组织病理形态结构，发挥抗骨质疏松作用。但氧化应激、炎性反应参与骨质疏松的机制尚未完全明确，葛根素和阿仑膦酸钠联合可在达到最佳治疗效果的同时减少激素用量，从而减少雌激素引起的副作用。因此，探讨中西结合防治PMOP是未来研究的重点，同时也为中草药的应用开辟了新的途径。