2'-岩藻糖基乳糖预防婴幼儿坏死性小肠结肠炎及感染性腹泻的研究进展

陆梦兰，陈财龙，徐加英，石羽杰，苏红文，刘 彪，秦立强,

（1.苏州大学公共卫生学院，江苏苏州 215123；2.苏州大学放射医学与防护学院，江苏苏州 215123；3.内蒙古伊利实业集团股份有限公司金山分公司，内蒙古呼和浩特 010110）

母乳成分独一无二，包含各种生物活性物质。母乳低聚糖（human milk oligosaccharides, HMOs）是母乳中一种特殊的碳水化合物，是母乳中除乳糖和脂肪以外的第三大成分，由单糖及衍生物、唾液酸等结构单元通过糖苷键连接而成[1]。随着国外首次实现HMOs的商品化应用，使得HMOs研究成为母乳研究的一大热点，具有巨大的学术与经济价值。2'-岩藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose, 2'-FL）作为HMOs的主要成分之一，具有调节肠道菌群、抗菌黏剂、免疫调节剂等重要的生物学功能[2−3]。

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是早产儿常见的一种非炎性小肠紊乱，早产儿NEC的高发病率与肠道发育不成熟密切相关，并受饮食和细菌定植的影响[4]。婴幼儿消化和免疫功能不全、肠道发育不成熟还是导致腹泻病的重要原因。2'-FL不仅可以作为益生元，还可能作为抗黏附抗菌剂和肠上皮细胞及免疫应答的调节剂，通过调节免疫系统和肠道菌群对NEC和腹泻病产生显著影响[5]。因此，本文综述了2'-FL的安全性及调节肠道菌群与免疫系统，尤其是其对婴幼儿NEC和感染性腹泻的预防作用。

1 母乳中的2'-FL

目前已鉴定出约200种HMOs分子，以中性的岩藻糖基化HMOs为主，2'-FL约占泌乳母亲HMOs总量的30%，由乳糖的半乳糖残基通过α-1,2键连接岩藻糖而形成。在不同妇女及整个哺乳期，HMOs的种类和含量不同，泌乳早期较高，并随时间逐渐降低[6]。HMOs随母乳直接进入小儿消化系统，只有不到5%被消化分解，绝大部分以原型随尿排出。

HMOs的组成反映了Lewis血型特征和泌乳状态，取决于某些糖基转移酶的表达。血型特征决定了特异性的岩藻糖转移酶2（FUT2）和FUT3的表达。分泌型母乳具有丰富的2'-FL和其他α1-2-岩藻糖化HMOs。相反，非分泌型母乳因缺乏FUT2，不含或者仅含少量2'-FL和其他α1-2-岩藻糖化HMOs[7−8]。另外，地理条件和环境因素也会影响HMOs中2'-FL的含量[1]。

2 2'-FL的安全性

在一项幼年大鼠亚慢性毒性研究中，使用不同剂量的2'-FL连续灌胃90 d，对照组采用目前认为安全并被批准用于婴儿配方奶的果寡糖。根据整体观察、体重、摄食量、眼底检查、器官重量、组织病理学综合评价，5000 mg/kg无任何不良反应，因此该剂量为未观察到有害作用水平（NOAEL），6000 mg/kg高剂量干预在体外也未检测到致突变性[9]。大量的临床试验评估了复杂的HMOs混合物用于婴幼儿食品的安全性，只有少数考虑了补充2'-FL配方的效果。潘丽娜等[10]用1 g/kg和2 g/kg 2'-FL的配方奶粉饲喂小鼠28 d，不但对小鼠的生长性能无影响，还提高了粗脂肪、钙、磷等营养物质的消化利用率。一项具有前瞻性的随机对照研究评估了含0.2 g/L或1.0 g/L的2'-FL与含2.2 g/L或1.4 g/L的低聚半乳糖的婴儿配方奶粉对美国28个地区从出生到4个月期间健康足月儿生长的耐受性和安全性，母乳喂养或64.3 kcal/dL配方奶喂养的婴儿在体重、长度和头围方面没有显著差异，未发生不良事件，而且配方奶粉和母乳喂养婴儿的2'-FL吸收代谢情况相似[11]。添加2'-FL的配方奶粉喂养的婴儿具有正常的生长模式和排便。目前还没有关于2'-FL不良反应的报道。因此，2'-FL是一种安全的婴儿配方奶粉的补充剂。

2'-FL的化学结构简单，可以通过工业手段规模生产。目前以基因工程方法为主，通过大肠杆菌菌株和酵母的微生物发酵产物生产2'-FL[12−14]。美国食品和药物管理局（FDA）将2'-FL、2'-O-岩藻糖基乳糖（2'-O-FL）和乳糖-N-新四糖（LNnT）三种 HMOs分类为安全的婴儿配方奶粉添加物。欧盟视HMOs为新型食品，2'-FL和LNnT均已通过安全性评价[15]。2019年欧洲食品安全局（EFSA）对2'-FL进行了评估[16]：“对于1岁以上的幼儿2'-FL和二岩藻糖乳糖（DLF）混合物用于婴儿配方奶粉、婴幼儿食品中，每日最大摄入量不超过4 g是安全的”。因此，2'-FL添加于婴儿配方奶粉有良好的前景。

3 2'-FL对肠道成熟及肠道菌群的影响

2'-FL能刺激上皮细胞的成熟，2'-FL单独或与3'-FL、6'-唾液酸乳糖（6'-SL）联合使用均可降低细胞增殖，增加肠上皮HT-29和Caco-2Bbe细胞的分化[17]。健康乳鼠口服2'-FL仅仅8 d就能显著提高小肠绒毛高度和面积，绒毛宽度也有增加趋势[18]。另外，用2'-FL和3'-SL干预大鼠8周后，明显增加了雌鼠盲肠重量和肠道通透性，并上调维持肠道屏障功能的重要基因mRNA表达，而且干预改善了雄鼠和雌鼠的肠道菌群的组成，有益肠道微生物增多[19]。因此，2'-FL能促进肠道成熟，并与调节肠道菌群有关。

婴儿出生时胃肠道从母亲和周围环境中获得乳酸菌、肠杆菌和链球菌定植，一周后出现双歧杆菌、拟杆菌和梭状芽胞杆菌。最近的一项纵向研究随访了5周龄婴儿至6~11岁，粪便微生物群分析结果表明，饮食是13周龄以后婴儿微生物群组成最重要的决定因素，母乳喂养的婴儿与婴儿配方奶粉喂养的婴儿肠道菌群组成不同[20]。顺产分娩和母乳喂养的婴儿往往免疫疾病发生率低，微生物群组成更健康，其肠道中双歧杆菌和乳酸菌占据主导地位，而大肠杆菌和其他兼性厌氧微生物则处于劣势。停止母乳喂养后，母乳喂养和配方奶喂养的婴儿之间差异消失[21]。早产儿粪便中变形杆菌的相对丰度增加，厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度降低，因此，优化早产儿肠道菌群是预防NEC的一种新策略[22]。2'-FL能提高双歧杆菌在肠粘膜上黏着能力[23]，并选择性地促进双歧杆菌的生长，主要是长双歧杆菌和两歧双歧杆菌，还可以刺激一些拟杆菌种类的生长[24−25]。这些细菌会产生短链脂肪酸等代谢产物，降低肠道的pH，促进肠上皮细胞再生，影响微生物群落的组成，限制有害微生物的生长和定植[26−27]。体外研究显示在含2'-FL的培养基上没有肠道杆菌科菌株生长，而含低聚半乳糖的培养基上包括病原体在内的一些肠道杆菌菌株生长良好[28]。另一项体外研究则发现大肠杆菌可同化利用摄入2'-FL后产生大量的醋酸盐从而使其相对丰度显著增加[29]。总之，2'-FL能增加有益菌比例和菌群丰度、促进肠道成熟，从而保护肠道免受外界刺激的损伤。

4 2'-FL的免疫调节作用

早期的研究认为2'-FL通过增加肠道中有益微生物的数量，从而增加了抗炎细胞因子、降低促炎细胞因子的表达，调节婴儿的免疫系统。但体外研究结果表明，2'-FL可以直接影响免疫细胞和细胞因子[30]。HMOs调节淋巴细胞的产生，促进T细胞反应向更平衡的Th1/Th2细胞因子转变[31]。2'-FL通过诱导IL-10（+）T调节细胞和稳定肥大细胞减轻食物过敏症状[32]。粘膜中树突状细胞表达的特殊糖结合蛋白可识别人乳低聚糖，发挥生理和免疫作用。2'-FL与树突状细胞特异性C型凝集素样细胞表面受体结合，直接与先天免疫细胞相互作用，从而改善了婴儿的适应性免疫[33]。2'-FL可以通过支持细菌CpG DNA调节肠上皮细胞释放半乳糖凝集素和TGF-βl的作用，促进肠道黏膜免疫发育[34]。

2'-FL还是固有性免疫系统的激活物，直接抑制炎症信号。在1型菌毛肠毒素性大肠杆菌侵袭的肠上皮细胞模型中，2'-FL通过调节CD14表达，抑制了脂多糖（LPS）诱导的炎症反应[35]。在鼠流感疫苗接种模型中，2'-FL饮食改善了疫苗接种小鼠的体液和细胞免疫应答，显著增加小鼠脾脏细胞中疫苗特异性CD4+和CD8+T细胞以及γ干扰素[36]。因此，2'-FL对固有免疫与获得性免疫都具有一定的调节作用。

5 2'-FL对坏死性小肠结肠炎的作用

NEC严重威胁出生体重极低婴儿的生命安全。母乳喂养、提高母乳质量、标准化喂养制度可降低NEC的发生率，而长时间不进食与NEC发病率和严重程度增加有关，因此出生后应尽快进行母乳喂养[37−39]。NEC的特点是肠缺血和坏死，其发病与人工喂养、微生物失调和过度炎症等有关，因此，降低促炎因子，诱导血管舒张分子内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达，保护小肠黏膜结构、维持肠系膜灌注，可以在一定程度上减少NEC的发生发展[40−41]。一些动物模型研究了2'-FL对NEC的保护作用。2'-FL能减少NEC模型新生小鼠和仔猪的凋亡、炎症反应、体重减轻和组织学改变，从而降低NEC的发生发展，其分子机制是2'-FL降低了TLR4介导的NF-κB 炎症信号[42−43]。2'-FL 还降低了 NEC 新生小鼠的促炎因子水平并保留了小肠黏膜结构，但2'-FL不能保护eNOS敲除小鼠或预先给予eNOS小鼠的NEC，进一步说明eNOS在改善NEC中的作用[42−43]。用低温低氧诱导小鼠幼崽NEC后给予2'-FL，仅3 d就能降低肠上皮细胞TLR4的表达，加速隐窝细胞的更新，保护肠上皮细胞免受损伤[44]。

动物实验虽然发现2'-FL保护NEC，但其程度不及混合HMOs[45]。用富含2'-FL的婴儿配方乳喂养剖腹早产猪5 d，2'-FL组出现NEC的比例低于对照组（50%vs.71%），但无统计学差异，两组肠道微生物群、肠结构和消化功能也无显著差异，这可能是早产猪肠道的定殖和肠道免疫还不成熟[46]。一项多中心临床队列研究显示，发生NEC的极低出生体重儿的母乳中的HMOs各组分，除了二唾液酸乳糖-N-四糖浓度明显降低，其他组分与对照组无明显差异[47]。也有证据表明，在早产儿出生后几周的配方奶中添加2'-FL对NEC敏感性没有影响。当肠道已经适应喂养和细菌定植时，将2'-FL引入早产儿的喂养可能更有利于改善肠道健康。2'-FL对NEC的效果还需要进一步研究。

6 2'-FL对感染性腹泻病的作用

在低收入和中等收入国家，腹泻仍然是5岁以下儿童患病和死亡的主要原因。针对五种病原体（轮状病毒、志贺氏菌、耐热性肠毒素大肠杆菌、隐孢子虫、典型的肠道致病性大肠杆菌）采取干预措施，可大大减轻中度至重度腹泻的负担[48]。许多病毒、细菌或原生动物病原体需要附着在粘膜表面，在宿主上定植或入侵引起腹泻。摄入2'-FL可使耐热性肠毒素大肠杆菌在小鼠肠道的定植率降低90%以上，并可降低肠道炎症，增加粪便短链脂肪酸含量，增强肠道屏障功能，预防耐热性肠毒素大肠杆菌感染[49]。另外一个研究也发现2'-FL能显著抑制产肠毒素大肠杆菌F18定植于仔猪肠上皮细胞，但对减缓F18感染的仔猪腹泻的作用有限[50]。2'-FL不但能提供非致病性共生体竞争优势控制病原体，而且还可以直接与病原体结合，减少肠道上皮表面接触微生物。大肠杆菌的热稳定性肠毒素STa通过与肠道粘膜结合的冠苷酸环化酶结合并刺激其产生cGMP而引起腹泻。在人结肠腺癌T84细胞中，2'-FL与冠苷环化酶受体结合，抑制了STa引起的氯离子稳态失衡[51]。2'-FL还能抑制弯曲杆菌在小鼠体内定植，抑制侵袭性致病性弯曲杆菌在体外与人肠道粘膜的结合[52]。

诺如病毒是婴儿腹泻的主要原因之一。在感染过程中，2'-FL通过模仿组织血型抗原（HBGAs）并结合在HBGA口袋中作为天然诱饵，阻止诺如病毒与其他血型抗原受体结合，保护婴儿免受诺如病毒的感染[53]。LAUCIRICA等[54]验证了 4种 HMOs在人诺如病毒G1P[8]和G2P[4]感染的非洲绿猴肾上皮细胞（MA104细胞）中的作用，在感染开始加入2'-FL使 G1P[8]的传染力下降 62%，但 3'-唾液乳糖（3'SL）+ 6'-唾液乳糖（6'SL）降低 G2P[4]传染力的能力更明显。因此，在配方乳中添加2'-FL有利于人工喂养的婴儿预防感染性腹泻病。

7 小结

2'-FL是HMOs的主要成分之一，动物和人群研究没有发现添加2'-FL的副作用，2'-FL有益于婴幼儿肠道菌群和免疫系统发展成熟。配方奶粉中添加2'-FL对婴幼儿腹泻病和坏死性小肠结肠炎有一定的保护作用。深入研究2'-FL对免疫系统和肠道微生物的有益作用机制，有助于为早产儿或易患病的特定婴儿群体开发新型和更有针对性的2'-FL婴儿配方奶粉。添加2'-FL虽然可行，但还需要大规模的队列研究以及以NEC为主要结局的随机临床试验来验证其效果及长期适应性和耐受性。此外，还需要进行临床前动物研究以探究其作用机制，以及2'-FL补充的最佳时间。另外，利用HMOs作为益生元对菌群可能存在选择性，6种母乳低聚糖的混合物能剂量依赖性地限制细胞因子诱导的FD4易位，并提高肠上皮屏障保护能力，2'-FL则发挥了关键作用[55]。因此，2'-FL与其他寡糖组合作为婴儿配方奶粉的补充剂也具有深远意义，需进一步研究其相互作用。最后，中国母乳HMOs数据有限，我国还缺乏2'-FL在食品行业中使用的相关标准，制备2'-FL的菌种选择、工艺路线设计、产品形态等均没有定论，因此，亟需国内研究机构和企业从基础理论到产品研发进行原创性研究，为特定的婴儿目标群体制定配方，服务于婴幼儿健康成长。