蛋白质硝基化与临床疾病

何旺青，谭梓雅，陈钰，周敏，常乐，姜淼，姜志胜

（1.南华大学衡阳医学院，湖南衡阳421001；2.南华大学心血管疾病研究所，南华大学动脉硬化学湖南省重点实验室，南华大学动脉硬化性疾病湖南省国际科技合作创新基地，基础医学博士后流动站，湖南衡阳421001；3.南华大学生物信息与医学大数据教研室，湖南衡阳421001）

蛋白质硝基化修饰指的是蛋白质中的酪氨酸残基硝化生成3-硝基酪氨酸（3-Nitrotyrosine，3-NT）。在各种病理条件下，炎性介质可以诱导多种活性氧（O2-、OH-、H2O2、ONOO-等）和活性氮（NO、NO2-、N2O3等）的产生，其中超氧阴离子（O2-）与NO的反应速度是正常情况下与超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）反应速度的3倍以上，因此NO首先捕捉O2-以较快速度生成过氧亚硝酸盐（ONOO-），其氧化能力比起单独存在的O2-和NO均显著提高。ONOO-可以与蛋白质酪氨酸残基或游离酪氨酸发生硝化反应生成3-NT。3-NT的生成除了可通过非选择性的ONOOˉ依赖途径外，还可以通过各种过氧化物酶（如髓过氧化物酶）、过氧化氢酶依赖的途径介导[1]。蛋白质发生酪氨酸硝基化修饰后，可能引起其功能受损或者酶活性下降。更严重的情况下可能导致线粒体、DNA损伤，抑制酪氨酸磷酸化，诱导细胞的凋亡和坏死[2]。近年来，随着对蛋白质硝基化研究的深入，发现在许多临床疾病，如动脉粥样硬化性疾病、糖尿病、神经退行性疾病、肺癌等的病变组织中都可以检测到3-NT水平升高，这提示3-NT与多种疾病密切相关。

1 蛋白质硝基化修饰与临床疾病的关系

1.1 动脉粥样硬化

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的特点是受累动脉的病变从内膜开始，先后出现脂质蓄积、纤维组织增生和钙质沉着，并伴有动脉中层的逐渐退变和钙化，在此基础上并发有斑块内出血、斑块破裂、局部血栓形成。该病的病因尚未完全明确，研究表明为多因素作用于疾病发展的不同环节所致。同样，有多种学说从不同角度阐述AS的发病机制，目前主流学说包括脂质浸润学说、内皮损伤-反应学说、血小板和血栓形成假说、平滑肌克隆学说以及氧化应激学说等。

临床研究表明，体内蛋白质硝基化水平的升高，可以作为动脉粥样硬化危险性的独立指标，且AS患者组织细胞内3-NT含量是正常人体内的90倍，蛋白质硝基化修饰通过多种途径参与AS的发生发展。载脂蛋白A-Ⅰ（Apoliopoprotein A-Ⅰ，ApoA-Ⅰ）作为高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein，HDL）的主要组成蛋白质之一，在AS患者血液中可以检测到发生髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）介导的硝基化修饰[3]，并且在AS患者胸主动脉内膜部位也可以检测到硝基化修饰的HDL，实验证明硝基化修饰的HDL介导胆固醇逆转运的能力显著降低[4]。硝基化修饰的低密度脂蛋白（Low-Density Lipoprotein，LDL）是氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）的主要成员之一，经巨噬细胞或平滑肌细胞清道夫受体摄取，是AS斑块内泡沫细胞的主要形成原因[5]。动脉粥样硬化的不同时期，在巨噬细胞丰富的损伤部位都可检测到3-NT，且3-NT在不稳定性斑块中的表达较在稳定性斑块中的表达明显增加[6]。血管平滑肌细胞的迁移是动脉粥样硬化疾病发病过程中的一个重要环节，有研究证实，游离的3-NT可以通过激活人动脉平滑肌细胞（AoSMC）的细胞外信号调节酶和ERK1/2信号通路，以及上调与细胞迁移紧密相关的一些因子（如血小板衍生生长因子受体B、基质金属蛋白酶2等）的mRNA及蛋白表达，从而促进AoSMC的迁移 以及AS发生与发展[7]。

综上，蛋白质硝基化修饰参与AS发生发展的多个环节，但多数实验均只证明了其与AS的相关性，3-NT是AS的成因还是其标志，目前仍有很大的争论。

1.2 糖尿病

糖尿病患者由于机体内胰岛素产生不足或利用障碍，导致机体糖代谢紊乱，出现持续性的高血糖。血糖升高会诱导机体内氧自由基清除系统受损，产生过量的自由基。有学者发现在糖尿病动物模型中，线粒体蛋白质上发生硝基化修饰的酪氨酸含量明显偏高，这种修饰后的蛋白质可能通过多种途径促进糖尿病的发生发展。

蛋白质酪氨酸硝基化可以导致胰岛β细胞功能障碍。胰岛内抗硝基酪氨酸免疫阳性的细胞群主要为胰岛β细胞或巨噬细胞，且Ⅱ型糖尿病患者胰岛素相比非糖尿病患者胰岛培养基中分泌的胰岛素水平明显减低，而3-NT表达显著增高，提示Ⅱ型糖尿病患者分泌胰岛素功能与3-NT水平关系密切[8]。

蛋白质酪氨酸硝基化还可引起胰岛素分子结构发生变化而影响功能，体外ONOO-处理胰岛素后发现，硝基化修饰的胰岛素与受体的结合能力以及降低血糖的能力均显著下降[9]。

蛋白质酪氨酸硝基化还可加速糖尿病并发症发展，心血管病变、视网膜病变和肾脏病变是糖尿病的常见并发症，血管病变是其重要原因[10]。3-NT主要通过促进氧化/硝化应激和炎症反应两个方面引起糖尿病大血管病变。TURKO等[12]在动物实验中发现，糖尿病高血压小鼠主动脉中3-NT蛋白的表达要明显高于正常血压糖尿病小鼠，且硝基化修饰后的琥珀酸辅酶A（氧代酸辅酶A转移酶，SCOT）的催化能力也显著下降，可能参与糖尿病心肌病变的过程[11]。此外，RNS可能部分通过激活经典的β-catenin/Wnt信号通路来介导糖尿病微血管渗漏和视网膜炎症细胞浸润。

1.3 3-NT与脑功能改变

蛋白质在亚细胞水平的硝化导致构象的改变，破坏细胞骨架，导致神经退化，可在阿尔茨海默病（AD）、帕金森病、亨廷顿病等疾病中作为神经退行性病变的促进因子发挥作用[13]。

氧化应激可能作为神经退行性病变的主要根源，随着年龄的增加，促进年龄相关神经退化[14]。在AD患者活化的神经胶质细胞中，NO与O2-表达均显著上调，产生的ONOO-损害患者蛋白质、脂质以及核酸[15]。Tau蛋白作为AD神经纤维缠结的重要组成部分，发生硝基化修饰后可以明显降低其微管结合能力，且3-NT修饰水平与AD患者认知能力减退正相关[16]。轻度遗忘性认知障碍（MCI）是正常衰老与痴呆和AD之间的过渡，有研究表明蛋白质硝基化损伤发生在MCI过程的早期，并且蛋白质硝化对于MCI转化为AD可能很重要[17]。脑白质高信号（WMHs）合并认知功能改变组患者血浆3-NT浓度明显要高于仅WMHs组[18]。脑小血管病患者血清中也具有较高的3-NT表达，而同时伴有认知障碍的患者中血清3-NT更高，提示血清3-NT与认知障碍密切相关[19]。

1.4 3-NT与呼吸系统疾病

肺作为呼吸系统的核心器官，出现氧化应激损伤是肺癌发生的主要原因之一。NO参与肺癌患者气道炎症的形成，负性调控表面活性蛋白基因表达损伤组织，诱导慢性炎症，增加细胞癌变风险[20]，NO介导的蛋白质酪氨酸硝基化也在这一过程发挥了重要作用[21]。肺癌患者血清3-NT浓度相对正常人群偏高，吸烟也可以明显增加血浆中3-NT的产生[22]。免疫组化和蛋白质印记实验显示，与非肿瘤部分相比，肺鳞状细胞癌与腺癌的癌组织硝基化酪氨酸水平显著增加，且蛋白质组学鉴定到25个具有3-NT的蛋白质，包括代谢酶类、结构蛋白以及抗氧化损伤的蛋白[23]。此外，在哮喘病人呼吸道上皮细胞中，也存在3-NT高表达，甚至在哮喘病人呼出的气体中，也能够检测到3-NT。动物实验也证实，对于呼吸道致敏的小鼠，在气管上皮细胞以及致敏的肺中都可以检测到3-NT[24]。

但是蛋白质硝基化修饰当前更多地被当作氧化损伤的标志物，其是否介导肺部疾病病理进程的改变还需要更多的研究进行证实。

2 结语

蛋白质酪氨酸硝基化与各类临床疾病关联紧密，无论是哪种临床性疾病，活性氧的增加是蛋白质硝基化修饰水平增强的共同特征。蛋白质发生硝基化修饰后可以改变其结构与功能，例如硝基化修饰可以使脂蛋白质更容易被细胞摄取，可以使部分酶（如胰岛素）功能下调或失活，还可以降低微管蛋白结合能力等，这些效应在细胞信号传导中可以发挥巨大的作用。

但当前大部分研究均只证明了3-NT与某一疾病的相关性，很少针对3-NT的生物学效应进行深入研究，这主要是由于细胞内发生酪氨酸硝基化修饰的蛋白质相对较少，同时与大规模筛选的策略欠缺相关。尽管近年来以生物质谱技术为代表的鉴定技术不断更新，但研究蛋白质酪氨酸硝基化修饰的难点仍然存在，需要探索出更多针对研究蛋白质硝基化修饰参与疾病的机制与策略，以期为防治各类疾病提供新思路。