饲料添加剂中5种有机酸的测定方法研究

侯林丛，黄好强，徐志海，王彩杰，向霞霞，张 星

（1.河南海瑞正检测技术有限公司，河南 郑州 450001；2.郑州赛科药业科技有限公司；3.河南牧经养殖技术研究院有限公司；4.河南牧业经济学院）

目前，饲料酸化剂中有机酸的测定方法有酸碱滴定法、离子色谱法、气相色谱法、气质联用法、液相色谱法等。高效液相色谱法具有分析范围广、检测速度快等优点，利用高效液相色谱测定有机酸大多是关于青贮发酵液、食品及饮料等，而利用高效液相色谱同时测定饲料添加剂中苹果酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸含量的报道较少，该方法在大量的实验基础上，建立了一种同时测定5种有机酸的高效液相色谱法，以期为基层饲料检验人员提供新的检测参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；高效液相色谱仪（美国waters公司）：配紫外检测器；超声波处理器（昆山超声仪器）；离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）。

苹果酸、甲酸、乙酸标准品：含量≥99.0%（北京坛墨质检科技有限公司；丙酸、丁酸标准品：含量≥99.0%（北京曼哈格生物科技有限公司）；磷酸（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液的配制

精密称取苹果酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸标准品100 mg于10 mL 容量瓶中，加少量超纯水溶解，用超纯水定容至刻度，摇匀，分别得出浓度为10.0 mg/mL 各有机酸标准贮备液，根据样品含量适当稀释成一系列混合标准工作液。

1.3 样品前处理

称取适量样品（根据样品中各有机酸含量称取0.2～2 g）于100 mL容量瓶中，加入70 mL超纯水，于超声波中提取20 min，期间不断摇晃促使溶解，用超纯水定容至刻度，1 000 r/min 离心10 min，取上清液经0.45 靘滤膜过滤，上机测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18柱，长250 mm，内径4.5 mm，粒径5 靘（大连依利特）；柱温：30 ℃；流动相：0.1 %磷酸溶液（pH 值2.5）：乙腈=98∶2；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；进样量：10霯。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

该文选用依利特C18色谱柱，针对不同比例的流动相对5 种有机酸的分离结果进行比较，结果表明，流动相中pH 值过高、有机相比例偏大均会影响5 种有机酸的分离效果，致使苹果酸和甲酸两个相邻色谱峰重合。当使用0.1%磷酸溶液pH值为2.5时，能够使5种有机酸进行有效分离。另外还实验了0.5%、20%等不同比例的有机相对出峰时间的影响，当有机相比例为0.5%时，丁酸保留时间在40 min左右，分析时间过长。有机相比例为20%时，甲酸保留时间在1 min左右，无法进行积分。当有机相比例为2%时，各有机酸保留时间不受杂质干扰，分析时间控制在30 min以内，且各物质都能得到完全分离。

2.2 标准曲线的测定

分别取25～1 000 靏/毫升系列混合标准溶液注入高效液相色谱仪中，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，该系列标准曲线线性良好，满足实际标准要求。

2.3 精密度的测定

按照本方法，选取同一饲料添加剂进行精密度试验，平行测定6 次，6 组数据的相对标准偏差（RSD）在8.0%以内，测定结果见表1。

2.4 回收率试验

分别取同一基质样品两份，一份为本底，另一份添加不同浓度的有机酸标液，回收率结果见表2。

2.5 讨论

该方法采用同一流动相利用高效液相色谱分析方法同时测定饲料添加剂中5 种有机酸的含量。该方法步骤简单、易于操作，重复性好，准确度高，可用于饲料添加剂中有机酸含量的分析与质量控制，具有很大的实用价值。□

表1 方法精密度测定结果

表2 方法回收率测定结果