灰树花杂交子的特性与分子鉴定*

权新华，武 鑫，温 蝶，温志强**

（1.福建农林大学菌物研究中心，福建 福州 350002；2.嘉兴市农业科学研究院，浙江 嘉兴 314016）

灰树花（Grifola frondosa）又名贝叶多孔菌、栗子蘑、云蕈、莲花菇、舞茸等，隶属于担子菌亚门（Basidiomycotina） 层菌纲（Hymenomycetes） 非褶菌目（Aphyllophorales） 多孔菌科（Polyporaceae） 树花菌属（Grigola），是一种中温型、好氧、喜光的木质腐生菌，在夏、秋季节常生于栎树、板栗树或其他阔叶树的树桩周围，是一种重要的食药兼用蕈菌[1]，具有巨大的潜在开发利用价值。

我国灰树花育种研究较晚，很多菌种都存在适应能力差、易染杂菌、生物转化率偏低等问题[2]，需要及时育种并筛选出优良菌株[3]。杂交是获得优良性状菌种的一种方法，能使遗传物质在细胞水平重组，从而将不同类型菌株的优良性状结合，并可通过菌丝体的无性繁殖稳固这种优良性状。

RAPD和ISSR分子标记技术已经广泛应用于食用菌的亲缘关系鉴定[4-7]。鉴此，通过这2种分子标记技术，以白色菌株Gr0001+3为杂交核心亲本，对与其他5株能正常开片朵型较好的菌株杂交后获得的13株杂交子进行鉴定，进一步验证杂交子分类地位。同时探索适宜杂交子生长的温度、pH等条件，为杂交子的开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株

灰树花（Grifola frondosa） 栽培菌株Gr0001+3与栽培菌株Gr0005、Gr0008、Gr0013、Gr0024、Gr0026单单杂交，观察筛选出具索状联合性状的13株杂交子，保藏于福建省食用菌种质资源保藏管理中心，菌株编号见表1。

表1 杂交子菌株编号Tab.1 Hybrid strains in the exprement

1.1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、琼脂 20 g·L-1，pH 自然。

1.2 杂交子理化性质测定

1.2.1 温度试验

制作90 mm的PDA平板培养基，每平板培养基定量20 mL。用6 mm打孔器在各杂交母种菌丝相同菌龄位置打孔，菌块接种于平板中央。接种完成后的平板分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃恒温培养箱中黑暗培养，每个菌株在不同温度试验下设置3个重复。用十字交叉画线法测定菌丝的生长速度。

1.2.2 pH 试验

用 1 mol·L-1NaOH 和 1 mol·L-1HCl制成不同pH 的 PDA 培养基，pH 分别调为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，每个90 mm平板定量20 mL培养基。用6 mm的打孔器在各杂交母种菌丝相同菌龄位置打孔，菌块接种于平板中央。每个菌种不同pH做3个重复。用十字交叉画线法测定菌丝的生长速度。

1.3 灰树花杂交子分子标记鉴定

1.3.1 菌丝培养及DNA提取

将杂交菌种接种于铺有玻璃纸的PDA平板上，25℃静置培养15 d后收集菌丝，采用CTAB法[8]提取全基因组DNA，置于-20℃储存备用。

1.3.2 引物与 PCR 扩增

选取经过多次检验且具有多拷贝的6条ISSR引物和RAPD引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息见表2。RAPD-PCR和ISSR-PCR扩增体系参照文献[9]的方法进行。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，电压110 V，电流50 mA，电泳50 min。后于紫外凝胶成像仪拍照。

表2 RAPD和ISSR引物序列Tab.2 The primer sequence about RAPD and ISSR

1.3.3 数据分析与图表绘制

使用Excel统计分析数据，取3组重复数据平均值绘制条形统计图。

2 结果与分析

2.1 温度对灰树花杂交子菌丝生长的影响

不同温度下杂交子菌丝生长情况见图1。

由图1所示，在PDA平板上，杂交子菌丝在15℃～30℃均可生长，生长速度呈先升后降的趋势，当温度升高到35℃时菌丝不再生长。杂交子最适生长温度25℃，同一对亲本杂交产生的杂交子在不同温度下生长速度也不同。25℃条件下，Z5-1、Z8-1、Z8-2菌丝生长速度最快。

2.2 pH对灰树花杂交子菌丝生长的影响

不同pH下杂交子菌丝生长情况见图2。

由图2可知，不同pH条件下杂交子菌丝生长速度不同，菌丝在pH 4～pH 8均可生长，生长速度呈先快后慢的趋势，其中最适生长pH为5，说明灰树花菌丝喜弱酸性，当pH为5时，杂交子Z5-1、Z5-3、Z8-1、Z8-2、Z26-2菌丝生长优于其他杂交子。

2.3 灰树花杂交子分子标记鉴定

RAPD和ISSR两种分子标记扩增杂交子与亲本条带电泳图见图3。

由图3所示，RAPD分子标记验证中使用S1518对Gr0001+3与Gr0005杂交产生的杂交子Z5-1扩增效果较好，亲本菌株与优势杂交子间的特异性条带较明显，从图中可以看出杂交子Z5-1的条带中同时包含了Gr0001+3和Gr0005的特异性条带，从而在DNA分子水平上证明了Z5-1是Gr0001+3和Gr0005真正的杂交子。

同理ISSR分子标记验证中，ISSR2、ISSR4、ISSR12、ISSR13、ISSR816也对多个杂交子及亲本扩增良好，亲本菌株与优势杂交子间的特异性条带较明显，从图3中可以看出杂交子同时含有两亲本特异性条带，证明了杂交子的真实性，也验证了这几个ISSR引物鉴定灰树花杂交子的可行性。

现有的6个引物并不能鉴定所有的杂交子菌株，其余杂交子菌株PCR电泳图只含有一个亲本菌株的条带，如杂交子Z13-1。当以ISSR4为引物进行扩增，Z13-1杂交子的电泳条带与Gr0013亲本的相似，不含有Gr0001+3的特异性条带，无法证明Z13-1是杂交子菌株。

3 讨论

杂交可以使亲本的基因重新组合，获得不同类型的杂交子，为选择提供丰富的材料。杂交子筛选是从大量杂交子中选出获得优良性状的杂交子菌株，杂交子在菌丝生长速度、菌丝耐受性等多方面存在一定差异。本研究将杂交获得的13个杂交子菌株放置于不同温度、不同pH条件下培养，并测定菌丝生长速度，结果表明13个灰树花杂交子的菌丝最适生长温度均为25℃，菌丝最适生长pH为5，不同灰树花杂交子菌株菌丝生长速度不同，其中Z5-1、Z5-3、Z8-1、Z8-2、Z26-2等菌株生长速度比其他菌株快。

杂交子代的鉴定和筛选是杂交育种中的另一个关键环节，可以通过观察锁状联合、拮抗试验、同工酶分析、分子标记、菌丝长速、出菇试验等方法进行鉴定和筛选[10]。分子标记分析待鉴定杂交子与双亲间的DNA特异性条带，若其同时具有双亲独有的条带，则可以断定其为杂交子，若其与任一亲本的条带完全一致，则不能确定其为杂交子[11-12]。DNA分子标记技术是基于基因水平上的分子鉴定，其具有不受环境影响且精确度高等优点，使鉴定结果更为可信。试验中选用RAPD和ISSR分子标记，对通过观察具有索状联合筛选得到的杂交子进行验证，用6个引物对13株灰树花菌株进行PCR扩增，其中7株灰树花杂交子菌株均包含各自双亲的特异性条带，因此，在DNA分子水平上证明这7株菌株是真正的杂交子，证明了RAPD分子标记和ISSR分子标记在验证灰树花杂交子方面的可行性。由于筛选的引物数量较少，仅有6个引物能鉴定出杂交子，而且还有6株杂交菌株并未鉴定出，其也有可能是真正的杂交子，需要筛选更多引物进一步验证。