气质联用法快速测定肉制品中N-二甲基亚硝胺

侯靖，卢跃鹏，陈丹，王梦颖，涂凤琴，刘梦婷

武汉食品化妆品检验所（武汉 430012）

肉制品是中国人餐桌上广受欢迎的美味，但是其可能存在的亚硝胺污染问题，成为消费者的一块心病。亚硝胺类化合物中受关注最多的是N-二甲基亚硝胺，其为二甲胺和亚硝酸盐作用形成的[1]，国际癌症研究所（IARC）将其列为2A级致癌物，即对人类致癌性证据有限，对试验动物致癌性证据充分的致癌物。GB 2762—2017规定肉制品中N-二甲基亚硝胺的限量为3.0 μg/kg。

无论是对肉制品中N-二甲基亚硝胺的污染情况调查，还是对N-二甲基亚硝胺控制方法的研究，均需要快速准确地对肉制品中N-二甲基亚硝胺含量进行检测。常见N-二甲基亚硝胺检测的前处理方法主要有水蒸气蒸馏法[2]、直接溶剂提取法[3]和QuEChERS法[4-5]等。水蒸气蒸馏法取样量较大，操作复杂，且耗时较长，同时前处理过程中的液液萃取易造成待测物的损失，采用同位素稀释的方法可以减少影响，增加定量的准确性[6]。因为同位素标样价格较昂贵，如何减少样品量，从而减少同位素标样的使用，成为需要考虑的问题。直接使用二氯甲烷溶剂提取，方法较为简便，前处理耗时短，且目标物损失少。但是对于含有脂肪的样品，二氯甲烷会同时提取出大量的脂肪，影响检测的准确性，并对仪器造成严重污染。N-二甲基亚硝胺的检测可采用气相色谱-热能分析仪法[7]、气相色谱-质谱法[8]、气相色谱-串联质谱法[2,4-5]和液相色谱-串联质谱法[9]。气相色谱-串联质谱法因检测灵敏度高、准确性好，成为N-二甲基亚硝胺检测的主流方法。

试验报道一种采用超纯水提取、二氯甲烷反萃取的简单前处理方法，结合气相色谱-串联质谱检测，同位素稀释法定量，用于肉制品中N-二甲基亚硝胺的快速检测。方法准确、可靠，可为食品科学研究及食品安全监管提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

7890B-7010气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Vortex-Genie 2涡旋混匀器（美国Scientific Industries公司）；Direct 8超纯水机（德国Merck公司）；超声波清洗机（英国Prima公司）。

N-二甲基亚硝胺（1 000 mg/L，美国O2si公司）；N-二甲基亚硝胺-D6（1 000 mg/L，美国O2si公司）；二氯甲烷（色谱纯，德国Merck公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准工作溶液的配制

将N-二甲基亚硝胺与N-二甲基亚硝胺-D6标准溶液用二氯甲烷分别稀释至100和1 000 ng/mL，得到N-二甲基亚硝胺与N-二甲基亚硝胺-D6标准工作溶液。

1.2.2 标准系列溶液的配制

分别吸取5，10，20，50，100，200和500 μL质量浓度100 ng/mL的N-二甲基亚硝胺标准工作溶液，加入5 μL质量浓度1 000 ng/mL的N-二甲基亚硝胺-D6标准工作溶液，定容至1.00 mL，得到质量浓度范围为0.5～50 ng/mL标准系列溶液。

1.2.3 样品处理

称取10 g粉碎后的样品于旋盖离心管中，加入100 μL质量浓度1 000 ng/mL的N-二甲基亚硝胺-D6标准工作溶液，加入20 mL超纯水，旋紧管盖后涡旋，超声提取30 min，冷却至室温后以4 000 r/min离心5 min。吸取2 mL水提取液，注意避免吸到沉淀的样品和水表层的油脂。提取液置于10 mL离心管内，加入2 mL有机溶液，充分涡旋混匀，以4 000 r/min离心5 min，移取有机溶液至进样小瓶中，进行分析。

1.3 仪器分析条件

色谱条件：进样口温度280 ℃；进样模式，不分流进样；进样量2 μL；色谱柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气，氦气（纯度＞99.999%）；载气流量1.0 mL/min；接口温度250 ℃；程序升温，50℃保持1 min，以10 ℃/min升至110 ℃，保持3 min，以40 ℃/min升至230 ℃，保持1 min。质谱条件：离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；碰撞能量70 eV；化合物离子对见表1。

表1 N-二甲基亚硝胺的保留时间和质谱参数

2 结果与讨论

2.1 仪器方法的优化

对于气相色谱，色谱柱的选择与升温程序的优化是获得良好色谱分离的关键。色谱柱选择方法，考察常用的弱极性色谱柱HP-5MS毛细管柱与极性的HP-INNOWAX毛细管色谱柱。试验表明，N-二甲基亚硝胺采用HP-5MS毛细管色谱柱分离时，色谱峰拖尾严重，采用HP-INNOWAX毛细管色谱柱分离时，峰型较好，且峰面积明显大于同等浓度试样在HP-5MS毛细管色谱柱分离时的峰面积，即具有更高的分析灵敏度。因此，选择HP-INNOWAX毛细管色谱柱作为试验用色谱组。对升温程序的优化，使N-二甲基亚硝胺在色谱柱上获得更好的保留，以获得更好的分离效果。质谱参数方面，对N-二甲基亚硝胺及N-二甲基亚硝胺-D6进行全扫描，获得母离子信息，并在不同碰撞能量条件下进行二级质谱扫描，获得子离子信息。选择丰度高、干扰少的子离子，确定N-二甲基亚硝胺及N-二甲基亚硝胺-D6的定量与定性离子对，并对碰撞能量做进一步优化。空白样品与10 μg/kg加标样品N-二甲基亚硝胺定量离子对色谱图见图1。

肉制品基质复杂，蛋白质、脂肪含量高，给前处理带来极大困难。由于N-二甲基亚硝胺极性较大，选择超纯水进行提取，尽可能避免脂肪等非极性物质的干扰。对获得的水提取液，采用等体积的有机溶剂进行反萃取，试验考察乙酸乙酯、二氯甲烷和乙腈反萃取的效果。结果表明，采用乙酸乙酯反萃取时，N-二甲基亚硝胺的绝对回收率较低；使用乙腈反萃取时，N-二甲基亚硝胺的绝对回收率最好，但是干扰物峰也更多，同时使用乙腈反萃取时需要增加盐析的步骤，增加前处理的复杂性。使用二氯甲烷反萃取的回收率也较好，干扰相对较少，故最终选择二氯甲烷进行反萃取。

2.2 线性范围与定量限

将N-二甲基亚硝胺及其同位素内标的标准系列溶液标准溶液进样检测，在0.5～50 ng/mL质量浓度范围内，以N-二甲基亚硝胺与其同位素内标的相对峰面积y和性对浓度x进行线性回归计算。线性方程为y=0.660 5x-0.029 3，相关系数R2=0.999 8，线性良好。在空白肉制品中添加不同量的N-二甲基亚硝胺，按该方法进行处理，以定量离子对性噪比不小于10计算，方法的定量限为1.0 μg/kg。

2.3 回收率与重复性

通过向空白肉制品基质中添加不同量的N-二甲基亚硝胺，分别制备低（1.0 ng/kg）、中（3.0 ng/kg）、高（10 ng/kg）3个浓度水平的空白加标样品，进行回收率试验，结果见表2。结果表明，N-二甲基亚硝胺在3个浓度水平下的平均回收率分别为120.9%，106.6%和97.5%，对应的相对标准偏差分别为5.90%，0.76%和1.51%。方法准确度和精密度良好，符合相关标准要求。

图1 空白样品（a）与10 μg/kg加标样品（b）N-二甲基亚硝胺定量离子对色谱图

表2 N-二甲基亚硝胺回收率及精密度（n=6）

2.4 实际样品检测

采用该方法对20批次市售肉制品进行N-二甲基亚硝胺含量测定，全部前处理过程耗时不超过2 h。结果显示全部样品均无高出定量限的N-二甲基亚硝胺被检出。

3 结论

建立一种基于同位素稀释-气相色谱-串联质谱测定肉制品中N-二甲基亚硝胺的方法，采用超纯水对样品进行提取，离心分离出水提取液后，用二氯甲烷进行反萃取，有机溶液进样检测。N-二甲基亚硝胺在1.0，3.0和10 μg/kg水平的加标回收率为97.5%～120.9%，相对标准偏差为0.76%～5.90%。相较GB 5009.26—2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》，方法前处理简单快速，有机溶剂消耗量只有国家标准的1/125，准确度与精密度良好，是一种高效环保的肉制品中N-二甲基亚硝胺检测方法。