复合酶解蛋白质工艺在食品工业中的应用及研究进展

许新月，李昶，崔文玉，弓志青，王延圣，王文亮

山东省农业科学院农产品研究所（济南 250100）

复合酶水解工艺是指根据不同酶的水解特性，针对不同底物进行特异性选择，将大分子物质转换为活性小分子的过程。目前复合酶水解工艺已被广泛应用于蛋白质、多糖、纤维素等物质的水解过程中，得到的小分子物质在抗氧化、降血压和提高机体免疫力等方面功效显著。同时，利用复合酶水解技术开发新产品以及改善传统加工工艺也是食品工业发展的方向之一。复合酶解蛋白质制备小分子活性肽是当前一大研究热点，利用该技术可以进一步丰富功能性活性物质种类库，提高工业生产效率，减少废弃物资源浪费。介绍了复合酶水解蛋白质工艺在动物、植物、藻类等不同来源蛋白质加工中的应用，综述了该技术在国内外食品工业中的研究进展，并对其发展趋势进行了论述。

1 复合酶水解在动物来源蛋白质中的应用

目前复合酶解的方法已被广泛应用于动物组织蛋白质的生产加工，在制备抗氧化肽以及其他生物活性肽方面效果明显。

1.1 畜牧类

羊骨中含有大量的胶原蛋白，普通加工方式胶原蛋白水解率低，造成不必要的浪费。酶水解羊骨粉，水解度大、多肽得率高，适合羊骨粉深加工生产。王钰慧等[1]以羊骨粉作为原料，通过复合蛋白酶以及风味蛋白酶进行双酶水解，同时比较了同步水解和顺序水解的效果，结果发现同步水解的多肽生成量和短肽得率明显高于单酶水解和顺序水解，最高为87.13 mg/g和57.24%。

将动物脑组织进行水解，得到的脑蛋白水解物在系统发育、生理功能的维持以及神经损伤的恢复中都具有重要的作用。刘守峰等[2]以鸡脑为原料制作鸡脑蛋白粉，使用中性蛋白酶和胃蛋白酶对鸡脑蛋白质进行分步双酶水解，肽得率为70.38%，效果显著。

卵黄高磷蛋白磷酸肽能够促进人体对钙、铁、锌等金属元素的吸收，蛋黄是卵黄高磷蛋白磷酸肽的优质来源，徐彩娜等[3]以蛋黄粗蛋白为原料，利用多种酶单酶水解与双酶水解的方式提取卵黄高磷蛋白磷酸肽。选择胰蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase酶，经过单酶水解与双酶水解进行比较，最佳酶组合方式是胰蛋白酶与Alcalase酶分步水解，经过水解蛋黄粗蛋白水解率最高，为18.12%。蛋清是食品中优质蛋白质来源，水解后产生抗氧化活性肽。Yuan等[4]利用响应面法优化了胰凝乳蛋白酶与胃蛋白酶水解乳清蛋白制备抗氧化肽的水解条件。通过氧化损伤模型和IgE结合能力，分别对所制备的肽的抗氧化活性和潜在致敏性进行评价。超滤后，乳清蛋白肽的抗氧化活性为30.86 μmol AAE/g DW，且具有较低的致敏性。该方法经济有效，可用于工业生产抗氧化肽。

1.2 海洋动物类

刺参营养价值丰富、脂肪含量少，是优质的蛋白质来源。随着刺参加工行业的发展，刺参内脏利用率低，产生大量刺参内脏废料。闫鸣艳等[5]以废弃刺参内脏为原料，提取刺参内脏蛋白质，利用菠萝蛋白酶和胰蛋白酶对内脏蛋白进行同步酶解，测试取得的水解蛋白抗氧化活性。双酶水解后的刺参内脏蛋白清自由基清除率为49.65%，超氧阴离子自由基清除率为52.66%，抗氧化活性明显。

海洋中丰富的动物资源提供了大量的功能活性物质，研究人员通过利用复合酶水解的方法对海洋动物来源蛋白质进行水解，得到了各种各样的生物活性物质，应用于各个方面的研究。王欣等[6]通过利用1%的中性蛋白酶以及0.1%的木瓜蛋白酶对直接打浆的哈氏仿对虾进行酶解，促进海洋蛋白水解成小分子咸味肽来提高咸度。在酶解过程中定时取样进行感官评定，测定其咸度同时进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明，双酶水解有效提高了咸度，通过双酶水解海洋蛋白提高咸度的方法能够促进开发适合心血管疾病病人的无钠调味剂。

邓尚贵[7]以青鳞鱼为原料提取得到青鳞鱼蛋白，利用木瓜蛋白酶与风味酶对青鳞鱼蛋白进行复合酶解，结果发现在一定时间范围内，随着时间增加，蛋白水解度增加。青鳞鱼蛋白水解产物在小鼠实验辅助治疗骨质疏松过程中与单一利用雌激素替代疗法治疗骨质疏松相比有着明显优势，超滤后的青鳞鱼蛋白水解产物和传统治疗骨质疏松的己烯雌酚同时使用，可降低单一用药对小鼠子宫的刺激作用，治疗效果明显。

丁树慧等[8]以脱脂海洋鱼粉为原料，通过中性蛋白酶与碱性蛋白酶进行双酶水解，得到脱脂海洋鱼粉低聚肽。并且通过响应面分析的方法得到双酶水解的最优条件，水解度最高可达41.84%，有效提高了低聚肽的产量。

胶原蛋白因其独特的结构，不易被人体消化吸收，将胶原蛋白进行酶解后生成小分子的胶原蛋白肽，具有人体易吸收的特点，对降血压、抗肿瘤、促进皮肤胶原代谢具有明显效果。随着我国水产品加工产业的发展，许多废料被产生，鱿鱼加工中产生的鱿鱼皮废料是理想的胶原蛋白肽来源。刘振峰等[9]以鱿鱼皮作为原料，使用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行双酶分步水解。通过单因素试验和正交试验对双酶分步水解过程进行优化，最优水解度为24.32%，DPPH清除率为90.34%，多肽转化率为58.68%。该方法为废弃鱿鱼皮的利用提供了理论依据，同时为鱿鱼皮胶原蛋白肽的进一步分离纯化具有较高的指导意义。

1.3 昆虫类

黄粉虫作为一种较为常见的昆虫，是优质的蛋白来源。虫体中含有丰富的氨基酸，其中人体必需氨基酸达到氨基酸总量的39.14%。研究人员在黄粉虫水解蛋白方面进行了大量的研究。张莎莉等[10]利用胰蛋白酶和碱性蛋白酶Alcalase对黄粉虫进行双酶同步水解，并且对双酶水解过程中各个影响因素进行单因素试验后进行响应面优化，使用优化后的条件，水解度最高为21.61%，为黄粉虫的深加工提供了依据。何桂梅等[11]在张莉莎研究的基础上使用碱性蛋白酶和胰蛋白酶，对黄粉虫幼虫的水溶性蛋白进行水解，对水解过程进行二次正交旋转组合试验以确定最佳水解条件，制备抗氧化肽。其羟自由基清除率最高达85.46%，复合酶酶水解效果显著。

2 复合酶水解在植物来源蛋白质中的应用

植物蛋白质与动物蛋白质相比，结构简单，相对分子质量小。酶解后的植物小分子蛋白活性高，易被人体吸收，具有抗氧化、降血压、抑菌等功效[12]。

2.1 豆类

大豆中含有丰富的植物蛋白，是简单易得的蛋白质来源。大豆多肽中所含有的氨基酸与大豆蛋白质基本相同，但大豆多肽具有的易消化、低过敏性的特点，更适合开发大豆深加工产品。现已有研究人员对大豆蛋白水解形成大豆多肽进行研究，通常是利用一种蛋白酶对大豆蛋白进行水解。宋永康等[13]以大豆蛋白为原料，利用Alcalase蛋白酶、Protes.7L蛋白酶对豆粕蛋白进行单酶、双酶分步、双酶同步水解的比较。其中，先Alcalase酶后加Protes.7L蛋白酶分步水解，水解液的水解度最高达23.5%。

绿豆多肽相对分子质量小，水溶性好，易吸收，具有降胆固醇、抗氧化、提高机体免疫力等功能。马诗文等[14]以绿豆蛋白为原料，利用碱性蛋白酶与中性蛋白酶对绿豆蛋白进行水解，以水解度为指标优化水解工艺。通过单因素试验与正交试验优化得到最佳水解条件，水解度达到33.95%，DPPH自由基清除率达到82.8%，超氧阴离子自由基清除率达到76.82%，羟自由基清除率达到56.85%，绿豆蛋白水解产物具有良好的抗氧化活性。

2.2 玉米

我国玉米产量的增长，带动了玉米精深加工产业的发展。玉米加工副产物玉米黄粉蛋白质含量高，玉米蛋白质经过酶水解能够得到大量的活性多肽。王晓杰等[15]以玉米黄粉为原料，利用Alcalase酶、Protamex酶、Flavourzyme酶分别进行双酶分步水解，研究双酶分步水解对玉米肽功能性质的影响。结果发现，Alcalase酶、Flavourzyme酶双酶分步水解与Alcalase酶、Protamex酶双酶分步水解，两种水解方式抗氧化活性最佳出现时间均为150 min，表明在实际加工过程中可以通过控制双酶分步水解的时间来提高水解液的抗氧化活性。

2.3 大米

大米产量丰富，营养价值高，蛋白质含量丰富。大米蛋白质经过水解得到的大米多肽稳定性好，可作为添加剂应用于化妆品等工业生产。问题大米不符合我国食品安全法加工原料要求，不能食用。彭斓兰等[16]利用问题大米生产抗氧化肽，为问题大米的处理提供了新途径。该研究以抗氧化活性为指标，利用胰蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶对大米蛋白进行水解研究。对单酶水解与双酶水解进行比较，结果表明胰蛋白酶与碱性蛋白酶进行复合水解的水解产物具有较好的抗氧化活性，可应用于功能食品的开发。徐敏等[17]以大米米渣蛋白为原料，先将大米米渣进行超声处理，后通过碱性蛋白酶进行水解，确定超声与碱性蛋白酶联合使用条件，在此基础上使用中性蛋白酶进一步水解，测定降血压肽活性。将中性蛋白酶水解、碱性蛋白酶水解以及双酶复合水解后血管紧张素转化酶（Angiotensin-converting Enzyme，ACE）活性进行比较，结果发现三组试验不具有明显差距，双酶水解时间缩短了，并提高了生产效率。

2.4 小麦

谷朊粉是活性小麦面筋蛋白，经过酶水解得到生物类活性多肽，乔晓林等[18]利用活性小麦面筋蛋白（谷朊粉）进行双酶水解以得到抗氧化肽，以水解后多肽的抗氧化活性为指标，对双酶水解的过程进行了研究。该研究选择木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶进行研究，将3种蛋白酶分别进行双酶复配，研究不同复配方式对水解蛋白抗氧化活性的影响。结果显示，木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶分步水解组分表现出较强的抗氧护活性，对小麦加工产业的发展提供了参考。小麦蛋白中含有大量的谷氨酰胺，潘丽军等[19]以小麦蛋白为原料，选择碱性蛋白酶与胰蛋白酶分步水解制备谷氨酰胺活性肽。通过单因素试验和正交试验优化水解过程，得到最佳双酶水解条件：先利用碱性蛋白酶进行水解，再利用胰蛋白酶水解效果。谷氨酰胺活性肽得率最高达61.38%，效果显著。

2.5 胡萝卜

Yu等[20]以胡萝卜为原料，采用复合酶法、超细粉碎法和高静水压法对胡萝卜渣中提取的不溶性膳食纤维进行改性，并对其结构、理化和功能特性进行了评价。通过纤维素酶和木聚糖酶双酶水解的方法水解胡萝卜超微粉碎渣，复合酶法将不可溶性膳食纤维含量提高到15.07%，有效提高了胡萝卜不可溶性膳食纤维提取量，对接下来的试验提供了帮助。

2.6 菜籽

菜籽蛋白作为良好的蛋白来源，已逐渐成为研究热点。葛焱等[21]以菜籽蛋白为原料，对复合酶水解过程进行研究，以蛋白水解度为指标，先利用碱性蛋白酶对菜籽蛋白进行水解，再利用木瓜蛋白酶进行水解过程，此时蛋白水解度最高，最终选定利用双酶分步水解的方法进行菜籽蛋白研究。

3 其他

3.1 酪蛋白

酪蛋白作为寡肽，具有比氨基酸更好的吸收效果。王桂春等[22]以酪蛋白为原料，采用单酶水解与复合酶分步水解得到ACE抑制肽。首先使用胃蛋白酶水解酪蛋白，得到活性较高的ACE抑制肽，以此水解物为底物使用胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶进行复合酶水解，研究复合酶水解条件。将碱性蛋白酶水解进行双酶复合水解后，ACE抑制率提高不明显，其中小分子肽含量明显升高。该试验方法为蛋白酶水解小分子肽提供了研究方向。

3.2 乳清蛋白

在乳产品加工产业中会产生大量的乳清废料，包怡红等[23]利用乳清蛋白制备ACE抑制肽，为乳清废料的利用提供了参考。以乳清蛋白作为原料，通过碱性蛋白酶与胰蛋白酶进行双酶分步水解，以ACE抑制肽为指标，确定最优水解工艺，水解度最高为11.29%，ACE抑制肽抑制能力最强达到60.19%。

3.3 明胶

胶原水解后产生明胶，明胶蛋白含量高，不含有脂肪，是良好的蛋白来源，被广泛应用于食品行业。安广杰等[24]以明胶为原料，通过胰蛋白酶与中性蛋白酶双酶水解的方法制备水解明胶。首先使用单酶水解的方法对水解酶进行筛选，选择水解度较高的水解酶进行复配，在双酶水解单因素试验后进行正交筛选最优双酶水解条件。结果发现，双酶水解效果明显，水解度最高为15.79%，多肽含量为56.87%。

3.4 藻类蛋白

近年来研究发现藻类植物中含有大量的生物活性成分，海洋微藻多肽具有抗氧化、降血压的功效。武琼等[25]利用裂壶藻废料提取抗氧化肽，以裂壶藻废料提取得到的蛋白质为原料，采用复合蛋白酶与Alcalase酶复配（1∶1，W/W）水解，6 h后抗氧化活性最高，还原力为1.417（质量浓度3 mg/mL），具有较好的抗氧化活性。马莹等[26]以螺旋藻为原料，提取得到藻胆蛋白，使用胃蛋白酶与胰蛋白酶对藻胆蛋白进行双酶分步水解，提取得到血管紧张度转换酶（ACE）抑制肽，并确定最佳酶解工艺。其ACE抑制肽抑制率为80.35%，超滤后得到小于3 kDa的藻胆蛋白肽，抑制率为94.3%。通过双酶分步水解得到的螺旋藻蛋白肽，水解效果好，抑制率高，为藻蛋白开发提供了理论依据。

岩藻黄素是一种类胡萝卜素，存在于海洋褐藻中，对人体健康有多种有益的作用，如抗糖尿病、抗肥胖、抗癌和抗氧化等。海带是海洋褐藻的一种，胡萝卜素含量丰富。Xu等[27]以海带为原料，微波协同果胶酶与纤维素酶水解得到岩藻黄素，结合响应面法和Box-Behnken设计法对酶用量、复合酶配比和微波温度进行了研究和优化。在优化的提取工艺参数下，岩藻黄素提取率为0.443 mg。因此，在高效率、低能耗的系统中，这种方法可以实现。

4 结语

复合酶水解工艺因其环保、绿色、节约等特点，已被广泛应用于食品工业中。根据原料的不同需要，选择不同的复合酶水解工艺，得到所需活性产物。复合酶水解工艺在蛋白质水解领域使用最为普遍，在其他来源大分子物质（胶原蛋白、纤维素）等方面的应用也比较广泛。复合酶水解工艺在食品行业中的规模性广泛应用还要取决于高效能的酶制剂的研究。随着科学技术的不断进步，对酶的选择性、操作可靠性、稳定性不断深入研究，复合酶水解工艺效率不断提高，人类终将能解决复合酶水解工艺中如酶失活、费用较高等缺点。复合酶水解工艺在食品工业中的应用前景十分广阔，其优越性日益显著，将推动21世纪食品研究开发产业向前发展。