枣仁安神胶囊对小鼠睡眠作用及其机制的实验研究

陈巍巍，单伟

(1.锦州医科大学附属第一医院重症医学科一病区；2.锦州医科大学基础医学院解剖学教研室，辽宁 锦州 121000)

近年来，随着经济发展的快速增加，物质的日渐丰富，人们生活节奏也前所未有的加快。因此，不同程度的焦虑等神经或精神症状也日渐增多。报道显示，10%～15% 的成年人符合失眠症临床标准[1]。另外，失眠症造成的间接后果性损害(如工伤、病假等)明显大于直接损害(如失眠症治疗所需费用等)[2]。因此，安全有效的镇静催眠药物一直是临床和基础研究者的研发热点之一。我国传统经典药物枣仁安神胶囊单独应用或者联合其他药物使用对失眠症患者、冠心病伴焦虑抑郁患者的临床效果较好[3-6]，但对该药的相关机制研究尚少见。基于此，本组资料枣仁安神胶囊对小鼠镇静催眠作用和机制进行探讨，为该药的应用和机制提供理论依据，以期为失眠症治疗提供新思路。

1 实验材料

1.1 药物

枣仁安神胶囊(贵州同济堂制药有限公司批号131202)，阳性对照药(康斯顿广州万康保健品有限公司，20180311；巴比妥钠(EXP:20190221)、戊巴比妥钠(EXP:20190311)，sigma公司。A1R和A2AR抗体，cy3标记二抗。

1.2 动物

昆明种小鼠，雄性，体重18～22 g。许可证号：SCXK(辽)2010-0001。

1.3 仪器

石蜡切片机(德国莱卡LEICA-RM2135)、流式细胞仪(美国BD公司FACS Calibur)、荧光化学发光凝胶成像系统(以色列MF-ChemiBIS3.2)、光学显微镜(OLYMPUS，bx60日本)等。

2 实验方法

2.1 分组与给药

实验分4组：空白对照组、枣仁安神胶囊低、中、高剂量组(0.19、0.38、0.76 g/kg)，康斯顿阳性组(0.45 g/kg)，连续30 d，灌胃给药，每10 g用药0.2 mL。实验开始与结束，记录并分析体重。给药30 d后，取肝脏、肾脏，常规石蜡切片，苏木素-伊红染色(HE)。

2.2 直接睡眠实验

空白对照组给予同体积溶剂后，是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标，当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位。如超过30～60 s不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，记录入睡动物数及睡眠时间。

2.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验[7]

正式实验前先进行预实验，确定使动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的戊巴比妥钠剂量，用此剂量正式试验。在末次灌胃15 min后，给各组动物按90 mg/kg(依据预实验结果)ip戊巴比妥钠(10 mL/kg)，以小鼠翻正反射消失为睡眠指标，记录睡眠时间。

2.4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验

确定戊巴比妥钠阈下催眠剂量40 mg/kg，即80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥钠最大阈下剂量。用此剂量进行正式实验。在末次给药15 min后，给各组动物按40 mg/kg(依据预实验结果)ip戊巴比妥钠(10 mL/kg)，以小鼠翻正反射消失达1 min以上作为入睡判断标准，记录30 min内各组入睡动物数和睡眠发生率。

2.5 巴比妥钠睡眠潜伏期[8]

确定使动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的巴比妥钠剂量230 mg/kg，用此剂量正式试验。实验在末次灌胃15 min后，给各组动物按230 mg/kg ip巴比妥钠(10 mL/kg)，以小鼠翻正反射消失为指标，观察睡眠潜伏期。

2.6 流式细胞仪检测小鼠脑组织中A1R和A2AR

末次给药30 min后，取空白对照组、枣仁安神胶囊高剂量组小鼠脑组织，一半用于流式细胞仪检测，一半用于蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测。研磨为匀浆，用移液器反复吹散，过滤，离心，去除上清。按照说明书，按1∶100的比例稀释A1R和A2AR抗体，加入脑组织，洗涤，加入二抗，再次洗涤。上样流式细胞仪进行检测。Western Blot参考[9]，常规裂解、离心、变性、转模、孵育，β-actin为内参。

2.7 统计学方法

3 结 果

3.1 形态学检测和体重的结果

枣仁安神胶囊及对照组动物在给予枣仁安神胶囊60 min内，均未发生直接睡眠现象。给药期间小鼠腹泻、自主活动、皮毛等方面未见异常，肝脏、肾脏病理切片与空白组比较无异常，见图1。实验前，根据小鼠体重随机分组，实验结束时，各组小鼠的体重比较，差异不显著，即药物对小鼠的体重增长无影响，见表1。

表1 枣仁安神胶囊对小鼠体重的影响

图1 肝脏和肾脏组织病理图(HE染色)

3.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响

与空白对照组比较，枣仁安神胶囊高剂量组睡眠发生率明显增加，差异显著。枣仁安神胶囊低、中剂量组、阳性组延长睡眠时间，但无统计学差异。表明枣仁安神胶囊能延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，见表2。

3.3 巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

与空白对照组比较，枣仁安神胶囊高剂量组睡眠潜伏期明显减少。低、中剂量组降低睡眠潜伏期，但无统计学差异。表明枣仁安神胶囊能减少巴比妥钠睡眠潜伏期，见表3。

3.4 小鼠脑组织中A1R和A2AR表达

流式和Western Blot检测显示：枣仁安神胶囊高剂量组与对照组比较，A1R和A2AR表达明显增高，见图2。

表2 枣仁安神胶囊对戊巴比妥钠诱导小鼠体重睡眠时间的影响

表3 枣仁安神胶囊对小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

A：流式细胞仪检测结果图；B、C：Western Blot的方法检测结果(*P < 0.05与空白对照组相比)

4 讨 论

失眠症指的是由于多种原因所引起的经常性睡眠减少，或者睡而易醒，醒后无法再次入睡，或者这不容易入睡，睡眠时间缩短，甚至彻夜难眠的一种病证。枣仁安神胶囊由酸枣仁(炒)、丹参、五味子(醋炙)组成，功效重点在补阴、敛阴，即滋补肾水，收敛肝阴，调节肝肾功能，达到体内阴阳平衡，养心安神的目的，可有效治疗失眠症。本研究首先考察了枣仁安神胶囊对实验小鼠体重的影响。结果提示，受试药物对小鼠体重无影响，从体重增长角度和病理实验证实该药物对生长情况没有影响。给药期间，实验动物腹泻、自主活动、皮毛等方面未见异常。实验结果初步表明了中药枣仁安神胶囊对生长情况及器官脏器安全性。目前，很多报道显示枣仁安神胶囊对失眠症患者临床效果良好。本实验从入睡情况和睡眠时间上分别考察了枣仁安神对睡眠的影响，结果显示枣仁安神胶囊具有改善睡眠的作用。与临床实验结果一致[3]167-168。本文采用阳性药康斯顿牌改善睡眠胶囊作为对照，主要成分酸枣仁提取物、远志提取物、牡蛎粉、茯苓提取物、百合提取物、硬脂酸镁；保健功能：改善睡眠；适宜人群：睡眠状况不佳者。该药物主要成分与我们受试药物相似，都含有酸枣仁，与受试药物都属于中成药，故选作阳性药物。关于睡眠实验结果显示，该阳性药物在推荐剂量下对小鼠有作用趋势，无显著性差异。可能的原因，我们推测可能由于实验中采用的阳性药剂量对戊巴比妥钠、巴比妥钠干预下的睡眠作用影响不明显。

临床研究和基础实验对于枣仁安神的药效学研究并不少见，但是对其作用机制研究尚不多见。本研究采用流式细胞术和Western Blot检测脑内蛋白的表达，对其改善睡眠的作用进一步探讨。腺苷是一种内源性的促进睡眠的物质[10]。据报道，在长时间的觉醒过程中，大脑特定区域中腺苷酸的分泌增加，这对增加睡眠内稳态起着非常重要的作用[11]。文献报道显示腺苷和稳定的腺苷类似物证明可以诱导实验动物入睡[12]。腺苷在生理浓度，通过膜受体结合级联调节细胞功能。在中枢神经系统中表达的腺苷受体有四种亚型:A1R、A2AR、A2BR和A3R。其中，A1R和A2AR与睡眠调节相关[13]。近年来，对有关腺苷与镇静催眠关系以及与腺苷和腺苷受体相关的药物研究日渐深入，研制腺苷受体相关镇静安眠药物[14-16]。本实验结果显示枣仁安神胶囊高剂量组脑内A1R和A2AR表达增加，提示枣仁安神胶囊可能通过提高A1R和A2AR而发挥作用。关于枣仁安神胶囊通过何种信号通路对腺苷受体发挥的调节作用有待进一步研究。

综上所述，本研究通过动物实验探讨枣仁安神胶囊的催眠作用及可能机制。结果显示，枣仁安神胶囊无论在增加睡眠时间还是缩短入睡时间方面均具有改善作用，并且可能与提高A1R和A2AR有关。