内翻型膝骨关节炎骨结构的形态学观察

邬波，柳椰，马旭，王佳媛，王译晗，焦递进

(1.辽宁省骨关节病重点实验室；2.沈阳市骨科医院关节外科，辽宁 沈阳 110044)

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是临床上最常见的关节慢性退行性疾病，临床表现为关节持续性疼痛、畸形及功能障碍，严重影响生活品质[1-2]。随着我国人口老龄化的不断发展，膝关节OA的发病率逐年增加，但膝关节OA的发病因素和病程进展机制并未十分明确。长期以来，内翻型KOA的原发病因常被认为是软骨细胞代谢异常、软骨基质被破坏，但随着对骨功能单位研究和认识的不断深入，有学者提出不均匀沉降理论[3-4]，认为膝关节OA造成的内外翻是由于外侧腓骨支撑导致疏松退变的胫骨平台内外侧不均匀沉降继发膝关节力线内移或外移，而后越来越多的研究表明内翻型KOA的病理改变可能涉及整个骨软骨结构，尤其是钙化层和软骨下骨，可能在内翻型KOA的发病和病情进程中发挥着重要作用[5]。本文采用组织学观察及免疫组化的方法，对人的膝关节OA胫骨平台的病理改变及成骨破骨活性异常进行研究，为进一步研究膝关节内翻的骨结构异常机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

新鲜胫骨平台标本取自2017年5月至2019年5月在我院行人工全膝关节置换术的42例KOA患者，其中男16膝，女26膝，年龄63～85岁，平均76.3岁。病程6～22年，平均12.4年。所有患病膝关节均伴有内翻畸形。纳入标准：(1)符合骨关节炎诊断标准，经保守治疗不能缓解的严重膝关节疼痛；(2)膝关节功能受限影响行走，膝关节内翻畸形严重，常态膝距在5 cm以上的患者；(3)活动时有骨摩擦感；(4)膝关节晨僵时间≤30 min；(5)膝关节骨性肥大伴有骨质增生；(6)术中见胫骨平台内侧磨损较重，磨损至软骨下骨质；外侧磨损较轻，软骨结构基本完好。排除标准：(1)不符合诊断及纳入标准者；(2)合并严重器质性疾病者；(3)合并有类风湿性关节炎、感染、骨肿瘤和创伤等其他膝关节疾病者。所有患者均自愿捐赠标本，并签署知情同意书，试验经沈阳市骨科医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 影像学检查

术前行影像学检查，通过下肢全长片和正侧位X线片观察测量下肢力线和内翻角度。

1.2.2 大体观察

获取新鲜胫骨平台标本，观察其软骨外观、颜色、光泽度、完整度，有无软骨磨损、软化、溃疡、裂隙和骨赘形成等。

1.2.3 组织学观察

大体观察后分别在胫骨平台内、外侧中央负重区取软骨-软骨下骨组织块，共计84个标本，大小为1.2 cm × 0.6 cm × 0.6 cm，并自然分为两组：内侧磨损组和外侧组。将标本置于10%甲醛溶液固定24 h，12%中性EDTA-2Na脱钙1.5 m，经梯度脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后作厚度为4 μm的连续切片。切片分别行HE染色和Masson染色(具体操作详见说明书)，观察两组透明软骨和软骨下骨的病理改变情况。

1.2.4 免疫组化分析

采用免疫组化SP法对两组石蜡切片进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、SOX9转录因子和骨钙素(OCN)免疫组化染色分析。切片脱水后，0.125%胰蛋白酶37 ℃下行抗原修复20 min，余下步骤按照SP-9001试剂盒说明操作，DAB显色，脱水透明，中性树胶封片。

免疫组化切片置于100倍Olympus显微镜下，随机选取每例临近潮线5个不重叠视野作图像分析，测定阳性颗粒平均灰度值，取每张切片的均值作为每例的测量值，比较两组TRAP、SOX9和OCN的蛋白表达情况。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 影像学检查

X线片观察内翻角度8°～22°，平均内翻角度为12.6°，见图1。

图1 下肢全长片及正侧位X线片

2.2 大体观察

所有标本均可见内侧磨损组软骨退变情况较外侧组更为严重。内侧磨损组软骨平台表面粗糙无光泽，多见软骨下骨暴露，平台边缘多发骨赘形成；外侧组相对软骨表面平整，局部有光泽，无软骨全层缺失，见图2。

左侧为内侧磨损组，右侧为外侧组

2.3 组织学观察

2.3.1 HE染色观察

外侧组镜下观察，软骨层厚，软骨细胞数量多且排列整齐，深层偶可见肥大细胞聚集，潮线完整且有复制趋势，无血管越过潮线生长，少见裂隙形成，见图3A；内侧磨损组软骨表面磨损严重，多发裂隙形成，软骨层变薄，软骨细胞数量少且排列紊乱，各层结构界限不清晰，潮线紊乱，血管越过潮线生长，软骨下骨板异常增厚，见图3B。

2.3.2 Masson染色观察

外侧组镜下观察，软骨胶原蓝染，软骨下骨板红染，软骨细胞密集，可见部分退变软骨从潮线升起红色火焰状突起使未钙化软骨出现红染，见图4A；内侧磨损组可见软骨胶原浅蓝染，软骨细胞疏松且紊乱，软骨表层纤维化，软骨下骨板红染，潮线模糊不清，有较多血管翳从潮线通过，侵蚀破坏关节软骨，见图4B。

2.4 免疫组化结果分析

免疫组化阳性细胞呈黄棕色，阴性呈蓝色。镜下观察结果显示，TRAP、SOX9和OCN均在潮线下的软骨下骨板表达，内侧磨损组与外侧组相比TRAP、SOX9和OCN表达均显著增加，且差异具有统计学意义，见图5。灰度测量结果见表1。

外侧组 内侧磨损组

外侧组 内侧磨损组

A：外侧TRAP；B：内侧TRAP；C：外侧SOX9；D：内侧SOX9；E：外侧OCN；F：内侧OCN(箭头所指为蛋白表达阳性，箭头数量大致显示出表达量的多少)

表1 免疫组化染色灰度值

3 讨 论

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是老年人常见的退行性关节疾病。随着我国老龄化的不断发展，膝关节OA的发病率逐年增加，严重影响老年患者的生活质量，给社会带来沉重的经济负担。膝关节OA的主要临床表现为膝关节疼痛、肿胀、活动受限的缓慢进展，在KOA终末期可致关节功能障碍甚至残疾[6-7]。膝关节OA患者晚期易出现膝屈曲内翻畸形，其主要特点为内侧软组织紧张，内侧副韧带及内侧角半膜肌腱挛缩，胫骨内侧平台软骨退变磨损[8]。膝内翻患者X线片可见关节周围骨质增生、关节间隙变窄，胫骨平台内外侧骨质结构发生改变[9]。

正常关节软骨为乳白色半透明状，平滑且有光泽，不含有血管、神经和淋巴。软骨由浅到深可分为4层，分别为浅表层、过渡层、辐射层和钙化层，前3层统称为透明软骨[10]。软骨下骨包括软骨下骨板和骨小梁结构。长期以来，软骨的退行性变化及异常代谢被认为是膝关节OA的始发病因，随着对骨软骨功能单位研究的不断深入，发现关节软骨退变与软骨下骨重塑的协同作用在内翻型KOA进程中发挥着极其重要的作用[11-12]。包括辐射层、潮线、钙化层及软骨下骨板在内的各功能单位，不仅在结构上紧密相连，更在生物学功能上相互影响、相互依赖，钙化层和软骨下骨的病变不但加快了软骨退变过程，甚至可能是内翻型KOA的始发原因[13]。

膝关节OA主要有3种临床表现。一是关节间隙变窄，软骨磨损，半月板被挤到关节囊的后侧和外侧；二是关节边缘形成骨赘，起到保护、稳定关节的作用；三是通常伴有软骨下骨硬化和骨囊肿，继而发生骨破坏。SOX9是骨软骨形成过程中的生物标志物，可以决定间质细胞向软骨细胞的分化，其对软骨的分化成熟具有重要的正向调节作用[14]。骨钙素(OCN)由成骨细胞合成用于骨形成，并在骨转换期间释放到循环血液中。在早期骨关节炎中通过骨矿化增强使骨代谢被激活，因此OCN是成骨细胞分化的主要表型特征之一[15]。TRAP是破骨细胞的标志性指标，主要反映软骨下骨破骨细胞变化情况[16]。在内翻膝患者的KOA进程中，股骨髁和胫骨平台产生软骨磨损，胫骨平台发生骨囊肿及软骨下骨硬化。本文检测的这3种因子通过不同途径解释膝关节OA的各种临床表现。

骨重建过程是通过成骨细胞与破骨细胞协同来完成的。成骨与破骨作用的变化均会影响软骨下骨的微环境，进而影响骨性关节炎的发生[17]。本研究中，内侧磨损组中TRAP的表达较外侧组明显增多，表明在骨重建的初始阶段，软骨下骨发生囊性改变，破骨作用增强，破骨细胞反应性增加。内侧磨损组中SOX9的表达较外侧组明显增多，可能是由于在机械力学的刺激下，软骨磨损增加，造成软骨修复能力增强，人体机制试图修复这种损伤，代偿性的增加了SOX9的表达，进而导致内侧磨损组的软骨下骨板异常增厚，该结果与临床观察一致。内侧磨损组中OCN的表达较外侧组明显增多，其反应机制可能与SOX9相似，机械力学磨损刺激下，为保护、稳定膝关节正常功能，体内合成大量成骨细胞进而形成骨赘。

综上所述，本试验结合组织学观察和免疫组化分析，对比骨性关节炎内翻膝关节两侧的胫骨平台，研究其病理改变及成骨破骨活性，证明了钙化层和软骨下骨与软骨一样，在内翻型KOA的发病和病情进程中发挥着重要作用，为进一步研究膝关节内翻的骨结构异常机制提供实验依据。但本实验也存在不足之处：缺少软骨中各因子含量的测量，无法与钙化层和软骨下骨中该指标含量进行对比分析；未进行影像学分析，缺乏具体的组织形态计量学参数。以上不足有待在今后的实验中进一步完善。