小鼠肝细粒棘球蚴感染模型中TLR2的表达及其对肝组织的影响

刘坪，董丹，王二强，徐小丹，孟娟娟，侯隽，王仙，吴向未，陈雪玲*

(1 石河子大学医学院，新疆 石河子 832002;2 石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832008)

棘球蚴病(echinococcosis)，又称囊型包虫病，是一种由棘球绦虫的幼虫引起的人畜共患寄生虫病，肝脏是其常见的发病部位[1-2]。在感染早期，临床症状不明显。而在慢性持续性感染阶段，囊肿的体积和数量增加从而形成占位性病变，可引起组织、器官的物理性损伤。此外，囊肿的破裂会对患者的生命和健康构成严重威胁，如过敏性休克等[3]。

固有免疫系统在识别入侵的病原微生物，抵抗人类寄生虫并启动适应性免疫过程中至关重要[4]。固有免疫细胞表达多种模式识别受体(PRR)，其中Toll样受体(TLR)是非常重要的一种，TLR几乎表达于所有免疫细胞，包括肝细胞，通过感知多种病原体(如蠕虫)并诱导获得性免疫在先天免疫中起重要作用从而参与了原生动物寄生虫的第一道防线[4-5]。TLR2作为识别病原体重要的一员，研究表明激活TLR1/2信号传导可以激活免疫反应，而TLR2/6信号的激活可以抑制T细胞免疫[6]。为了解囊型包虫病感染过程中TLR2的表达情况及其对免疫反应的影响，本实验通过构建继发型小鼠肝细粒棘球蚴感染模型，于不同时间点检测肝脏TLR2的表达水平，以及肝脏的病理改变，探讨TLR2与肝脏炎症的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康的雌性C57BL/6小鼠40只，周龄6～8周，体重(20±2) g，购自新疆医科大学第一附属医院实验动物中心。动物实验已获得石河子大学第一附属医院伦理委员会批准(A2017-068-01)。

1.2 实验试剂与仪器

RPMI1640培养基、苏木素、伊红(Solarbio公司)，胎牛血清(FBS)(BI公司)，TLR2抗体(Abcam公司)，HRP(中山金桥公司)，TLR2引物(上海生工公司)，RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(Thermo Fisher公司)，荧光染料(SYBR Green I)(康维公司)，实时荧光定量RT-PCR仪(BioRad生物工程公司)。

1.3 目的及内参基因引物设计

引物设计按照 GeneBank小鼠TLR2基因序列，以β-actin作为内参基因，引物均由上海生工公司合成，基因序列见表1。

表1 qRT-PCR引物

1.4 原头蚴采集和培养

从屠宰场采集新鲜自然感染细粒棘球蚴病的绵羊肝脏，用75%酒精消毒，然后以50 mL注射器无菌方式抽取完整的包囊内容物(囊液清澈)置于无菌瓶中，待原头蚴自然沉淀后，用含1%双抗(100 μ·mL-1青霉素和链霉素)的无菌PBS清洗3～5次，加入1640(含8%FBS，1%双抗)培养液至于CO2培养箱中培养待用。

1.5 小鼠肝细粒棘球蚴感染模型建立

将40只C57BL/6雌性小鼠随机分成对照组20只，实验组20只。实验组小鼠10%水合氯醛麻醉后，逐层开腹暴露肝脏(在剪开最后一层腹膜时，选取无血管无肌肉的最薄处剪开腹膜)，将含5 000个原头蚴(活性>90%)的悬液0.1 mL注入肝被膜下。对照组注射等量无菌PBS液。术后置于保温箱恢复体温，常规饲养，第3、7、14、21 d各随机取5只小鼠，颈椎脱臼处死后，无菌条件下解剖小鼠。每只小鼠根据病灶和病灶近旁采集肝组织2份，一份用于病理组织染色，一份用于肝组织RNA检测(-80 ℃备用)，评价以下指标：

小鼠一般情况：包括精神状态、毛发、饮食、活动、死亡等情况。

肝组织情况：(1)肉眼观察肝组织形态、颜色、肿物变化等；(2)HE染色：用4%多聚甲醛固定肝组织，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，梯度酒精脱水、二甲苯透明，苏木素、伊红染色后显微镜下观察肝组织病理学变化。

1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织中TLR2水平

Trizol法提取肝组织(重量一致)总RNA，并测定总RNA浓度。用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录成20 μL体系的cDNA(逆转录时根据浓度调整加入RNA体积，以保证加入的总RNA含量一致)。qRT-PCR的反应体系：12.5 μL SYBR Green Ⅰ，上下游引物共1 μL，cDNA 1 μL，无酶水10.5 μL。反应程序：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸10 s，共40个循环。以β-actin作为内部标准化参照，采用2-△△ct法计算mRNA的相对表达水平。

1.7 免疫组化检测肝组织中TLR2表达

肝组织经常规固定、包埋、切片、脱水处理等。加一抗、二抗孵育。由研究者及1名病理科医师釆用人工双盲法分别阅片评分。在高倍镜下随机计数5个视野进行观察，对阳性细胞(着色呈棕色细颗粒状)百分比进行评分：1%～10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。对染色强度评分：凡细胞质或细胞核不着色为0分，浅棕色为1分，棕色为2分，深棕色为3分。评分结果由上述2项指标的两积分相乘分为4级：0分为阴性(-)；1～4分为弱阳性(+)；5～8分为中等阳性(++)；9～12分为强阳性(+++)。

1.8 统计学分析

应用SPSS 20.0软件对实时荧光定量PCR及免疫组化染色数据分析，采用wilcoxon 符号秩和检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠一般情况

对照组小鼠一般情况正常，均未出现死亡现象；模型组小鼠一般生长情况，包括精神状态、饮食、活动等良好，且感染率100%，零死亡(表2)。

表2 两组小鼠一般情况

2.2 不同时间点两组小鼠肝脏组织形态变化

对照组肝组织形态完整，色泽深红，表面光滑，光镜下观察肝脏结构正常，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列整齐、肝小叶结构完整，无变性坏死(图1A，图2A)。模型组在感染后第3天，肝组织表面可见细小白点，随着感染时间的延长，肝组织表面的白色囊型物增大，在第14天、第21天明显可见白色囊型物凸出肝脏表面(图1B-E)，光镜下可见感染后第3天肝脏中围绕肝小叶周边可见轻度水样变性，少量异物样巨细胞及慢性炎性细胞浸润；第7天可见肉芽肿样改变，周围炎性细胞浸润，有增生的纤维组织包绕；第14天可见肉芽肿伴大量异物样巨细胞浸润，炎性细胞明显增多，见囊样结构形成；第21天可见肉芽肿改变，纤维组织增生明显，少许炎性细胞浸润(图2B-E)。

图1 不同天数小鼠肝组织形态

图2 不同天数肝组织HE染色(200×)

2.3 不同时间点两组小鼠肝组织中TLR2的表达(图3、表4)

图3 不同天数两组小鼠肝组织TLR2mRNA表达水平(*P<0.05)

表4 不同天数两组小鼠肝组织TLR2蛋白质表达情况 %

qRT-PCR结果显示：小鼠感染细粒棘球蚴后肝脏中TLR2 mRNA的相对表达量在第3、14、21 d均显著高于对照组，Z值及P值分别为：Z=-2.087，P=0.037；Z=-2.087，P=0.037；Z=-2.087，P=0.037，与对照组相比，差异有统计学意义(*P<0.05)(图3)。免疫组化结果显示：在3、7、14、21 d，模型组病灶处TLR2蛋白质表达高于对照组，Z值及P值分别为：Z=-2.023，P=0.043；Z=-2.023，P=0.043；Z=-2.023，P=0.043，Z=-2.121，P=0.034，与对照组相比，差异有统计学意义(*P<0.05)(表4，图4)。

图4 不同天数两组小鼠肝组织TLR2蛋白质表达(200×)

3 讨论

本研究通过开腹直视下肝脏(肝被膜)注射原头蚴的方法构建C57BL/6 J小鼠继发囊型包虫病模型，发现细粒棘球蚴寄生于中间宿主后，均定植在肝组织，感染率100%，创伤小，易于操作；而传统的腹腔接种法虽然易于操作，但是感染后形成的包囊往往分布在腹腔内各个器官，定植在肝脏的几率比较小(仅20.5%)，门静脉注射法感染率高达93.1%，但小鼠的门静脉较细，穿刺注射原头蚴时易引起大出血[7-8]。同时，感染后模型组小鼠肝脏表面可见大小不等的白点，随着感染时间的推移，在14、21 d时明显可见白色囊型物(包虫囊肿)凸出于肝脏表面；光镜下观察，早期感染组小鼠肝组织病灶周围有不同程度的炎性细胞浸润较对照组严重，后期随着虫体不断增大，21 d可见肉芽肿发生，且纤维化也不断增加，表明细粒棘球蚴感染后，首先发生了异物反应，在肝脏引起损伤和炎性反应，这与包虫病患者肝组织结果一致[9]。

TLR2通过识别病原体相关分子模式和内源性分子，调节各种免疫和炎症介质的基因表达，启动针对病原体的早期应答，诱发获得性免疫反应[10]。在非酒精性脂肪性肝炎模型中，TLR2-/-小鼠的肝细胞比野生型小鼠损伤更为严重[11]。TLR2在感染刚地弓形虫小鼠肝组织中明显过表达，同时肝脏病理严重程度随时间增加[12]。与野生型小鼠相比，TLR2-/-小鼠感染日本血吸虫尾蚴后,小鼠肝脏肉芽肿大小和纤维化程度显着降低[13-14]，而TLR2-/-小鼠感染利什曼原虫前鞭毛体第4周，肝脏炎症面积较小[15]。本研究显示，模型组的TLR2 mRNA及蛋白质相对表达量增高，且随着感染时间的延长，阳性表达呈升高趋势，提示TLR2阳性表达的肝组织处于炎性反应期，这与其他寄生虫感染研究相似。由此，我们推测宿主感染细粒棘球蚴造成损伤，反应性地引起被感染的肝脏发生炎症反应，可能与细粒棘球蚴感染后TLR2的高表达有关。日本血吸虫虫卵的分泌物通过TLR2- MyD88/MAPK信号途径诱导巨噬细胞向M2极化调节肝组织病理变化[13]，那么细粒棘球蚴感染是否具有类似的分子机制，经病理医师对连续切片(HE及免疫组化染色)进行观察后发现TLR2主要表达于单核巨噬细胞，本课题组将采用Western blot的方法完善肝组织TLR2蛋白水平表达变化，并获取肝脏巨噬细胞(枯否细胞)，检测TLR2及其下游信号蛋白表达情况，完善细粒棘球蚴感染后TLR2作用的机制研究。

综上所述，TLR2 mRNA及蛋白质高表达于细粒棘球蚴感染的小鼠肝组织，对小鼠肝脏炎性损害有一定影响，可能参与调节肝组织病理变化，有助于细粒棘球蚴在宿主体内长期生存，也将为研究囊型肝包虫病的致病机理提出新思路。