QuEChERS-UPLC-MS/MS-内标法测定肉制餐饮食品中5种罂粟壳生物碱

周迎春 杨盛茹 华向美 李单单

摘 要：建立改進的QuEChERS（quick， easy， cheap， effective， rugged， safe）方法，以内标法结合超高效液相色谱-串联质谱法（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）测定肉制餐饮食品中吗啡、可待因、那可丁、罂粟碱、蒂巴因5 种罂粟壳生物碱。样品经乙腈-体积分数0.1%氨水提取，净化包（2 g无水硫酸镁、50 mg N-丙基乙二胺，100 mg C18E）净化，选择含10 mmol/L甲酸铵的体积分数0.1%甲酸-水溶液和体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相，采用等度洗脱，使净化液中5 种罂粟壳生物碱经HILIC Core-shell色谱柱（50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，在多反应监测模式下利用电喷雾电离源正离子模式扫描获得质谱数据，内标法定量。结果表明：5 种罂粟壳生物碱可在8 min内有效分离，且罂粟碱、那可丁、蒂巴因在0.2～20.0 ng/mL质量浓度范围内线性良好，吗啡、可待因在1.0～100.0 ng/mL范围内线性良好，r均大于0.999，方法检出限为0.3～2.5 ng/mL，定量限为1.0～7.5 ng/mL，5 种罂粟壳生物碱的平均回收率为85.8%～107.4%，相对标准偏差为0.5%～4.7%。该方法操作简单、净化效果好、检测效率高，适用于餐饮肉制食品中5 种罂粟壳生物碱的快速检测。

关键词：超高效液相色谱⁃串联质谱;QuEChERS;5 种罂粟壳生物碱;餐饮肉制食品

Abstract： An analytical method using a modified QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rugged， safe） extraction procedure combined with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） with an internal standard was developed for the determination of five poppy husk alkaloids in meat products used in the catering industry， including morphine， codeine， nocictin， papaverine and thibaine. Samples were extracted with acetonitrile-0.1% （V/V） aqueous ammonia solution and the extract was purified with a mixture of sorbents： 2 g of anhydrous magnesium sulfate， 50 mg of primary secondary amine （PSA）， and 100 mg of C18E. Complete separation of the poppy husk alkaloids was achieved on an ACQUITY UPLC® HILIC Core-shell chromatographic column （50.0 mm × 2.1 mm， 1.7 μm） using a mobile phase composed of 10 mmol/L ammonium formate and 0.1% formic acid in acetonitrile by gradient elution. Mass spectrometric data were acquired using an electrospray ionization （ESI） source in the positive ion mode with multi-reaction monitoring （MRM）. The analytes were quantified by an internal standard method. The results showed that the five poppy husk alkaloids could be separated effectively within eight minutes and good linearity were obtained for morphine and codeine in the range of 0.2–20.0 ng/mL and for the other amines in the range of 1.0–100.0 ng/mL （r > 0.999）. The limits of detection （LOD） and limits of quantification （LOQ） were in the range from 0.3 to 1.5 ng/mL and from 1.0 to 5.0 ng/mL， respectively. Satisfactory recoveries for spiked samples were obtained in the range of 85.8%–107.4% with relative standard deviation （RSD） lower than 4.7%. In summary， the method is easy to operate and has good purification effect and high detection efficiency. It can be applied to the rapid determination of the five poppy husk alkaloids in meat products used in the catering industry.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; QuEChERS; five poppy husk alkaloids; meat products used in the catering industry

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-128

中图分类号：TS207.3                                        文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2021）12-0031-07

引文格式：

周迎春， 杨盛茹， 华向美， 等. QuEChERS-UPLC-MS/MS-内标法测定肉制餐饮食品中5 种罂粟壳生物碱[J]. 肉类研究， 2021， 35（12）： 31-37 . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210511-128.    http：//www.rlyj.net.cn

罂粟壳是罂粟采完鸦片后的干燥、成熟果壳[1]，它富含50多种生物碱[2]。吗啡、可待因、那可丁、罂粟碱、蒂巴因是罂粟壳中主要的生物碱成分，它们具有一定药用价值[3]，同时又具有一定成瘾性[4]，长期食用含有罂粟壳生物碱的食品，会导致发冷、出虚汗、乏力犯困、面黄肌瘦等症状[5]，严重时会出现味觉感知能力降低、注意力和记忆力衰退的现象[6]，损害机体神经[7]、内分泌及消化系统[8]，进而产生一系列病变，导致机体成瘾及慢性中毒，甚至引起死亡[9]。

国家药品监督管理局、卫生部以及公安部都明令禁止在食品中非法添加罂粟壳[10]，并针对其含有的5 种主要罂粟壳生物碱成分制定了相关的检验标准[11]。但是极少部分餐饮店制作的肉制餐饮食品中仍存在非法添加罂粟壳生物碱的现象[12]。

目前测定罂粟壳生物碱的方法尚无统一的国家标准。2018年4月，国家市场监督管理总局发布《食品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定》的公告中指出[13]，采用液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer，HPLC-MS/MS）法测定食品中的吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因。但与DB 31/2010—2012《食品安全地方标准 火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定 液相色谱-串联质谱法》中检测方法[14]相比较，前者前处理相对复杂，后者方法检出限（limit of detection，LOD）相对较高。高志莹等[15]采用UPLC-MS/MS法测定肉汤中5 种罂粟壳生物碱时需测定基质曲线，操作复杂，工作量大。

QuEChERS法是一种先经盐析[16]再经N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和C18分散固定相净化[7]的简单、快捷、高效的前处理方法;UPLC-MS/MS法利用特征离子碎片定量[18]，具有检测速率快、灵敏度高、特异性强、准确性高的优点，是国际领先的检测技术[19];内标法通过添加同位素内标物质可以有效补偿样品前处理的损失和离子化时的基质效应[20-21]，从而大大提高检测准确性，尤其适用于复杂基质样品的检测[22]。考虑到同位素內标价格昂贵，因此本研究采用可待因-D3和吗啡-D3作内标进行定量，同时对QuEChERS法进行优化改良，建立一种利用QuEChERS-UPLC-MS/MS法测定肉制餐饮食品中5 种罂粟壳生物碱的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卤肉、羊肉汤、牛肉汤、骨汤膏等均购买于某商场。

净化包（2 g无水硫酸镁、50 mg PSA、100 mg C18E） 月旭科技（上海）股份有限公司;混合标准品溶液（吗啡、可待因质量浓度为50 mg/L，那可丁、罂粟碱和蒂巴因质量浓度为10 mg/L）、混合内标溶液（内标物吗啡-D3、可待因-D3质量浓度均为20 mg/L，-18 ℃避光保存） 上海安谱科技股份有限公司;所有实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

XEVO TQ UPLC-MS/MS 美国Waters公司;5810R型离心机 德国Eppendorf公司;KQ 5200DE型数控超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司;XPE 205型分析天平（感量0.01 mg） 瑞士Mettler-Toledo公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取2.00 g试样（精确至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加入50 μL同位素内标工作液（固体类样品加2 mL水），振摇使样品分散均匀，加入5 mL体积分数0.1%氨水-乙腈，涡旋振荡5 min，以4 000 r/min离心5 min，取上清液待净化。

在待净化上清液中加入净化包，涡旋混合30 s，以4 000 r/min离心5 min，移取上清液，用0.22 μm有机滤膜过滤，取适量滤液上机测定。

1.3.2 标准溶液与内标溶液的配制

5 种罂粟壳生物碱混合标准储备液：取混合标准品溶液1 mL于100 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，摇匀，即得含罂粟碱、那可丁、蒂巴因质量浓度为100 ng/mL，吗啡、可待因质量浓度为500 ng/mL的混合标准储备液。4 ℃避光保存，有效期3 个月。

同位素内标工作溶液：分别精密吸取混合内标溶液适量，用乙腈配制成吗啡-D3、可待因-D3质量浓度均为5.0 mg/L的同位素内标工作溶液。4 ℃避光保存，有效期3 个月。

混合标准工作溶液：分别精密吸取上述混合标准储备液和同位素内标工作溶液适量，用乙腈稀释成罂粟碱、那可丁、蒂巴因质量浓度梯度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL，吗啡、可待因质量浓度梯度为2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的系列混合标准工作溶液，吗啡-D3、可待因-D3内标溶液质量浓度均为50.0 ng/mL，现配现用。

1.3.3 UPLC-MS/MS检测条件

色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC® HILIC Core-shell色谱柱（50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱温30 ℃;流动相A为体积分数0.1%甲酸-水溶液（含10 mmol/L甲酸铵），流动相B为体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液;等度洗脱，流动相A与流动相B体积比为1∶9;流速0.3 mL/min;进样量5.0 μL。

质谱条件：电喷雾电离源，正离子多反应检测模式采集，离子源温度110 ℃，脱溶剂气温度350 ℃，脱溶剂气流速650 L/h，锥孔电压30 V，毛细管电压1.5 kV，吗啡、可待因、那可丁、罂粟碱、蒂巴因、吗啡-D3及可待因-D3质谱参数见表1。

1.4 数据处理

图谱采集及定性、定量分析均采用Mass Lynx V4.1軟件，采用Excel 2016软件进行图形绘制和数据处理。

2 结果与分析

2.1 UPLC条件优化

由于肉制餐饮食品往往蛋白、脂肪含量高，基质相对复杂，在雾滴表面离子化过程中，样品基质中的非挥发性组分与待测物质非常容易产生竞争，影响电喷雾接口处的离子化效率，进而增强或抑制被分析物离子的形成效能，产生基质增强或抑制效应，使检测灵敏度和准确度下降[23]。因此，通过加入同位素内标、稀释或浓缩样品、选择合适的色谱柱、优化流动相梯度洗脱程序等方法有效降低或消除基质干扰及基质效应。

考察ACQUITY UPLC® BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）、ACQUITY UPLC® BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）和ACQUITY UPLC® HILIC Core-shell（2.1 mm×100 mm，2.7 µm）3 种色谱柱对肉制餐饮食品中5 种罂粟壳生物碱分离效果的影响。

由图1A～B可知，使用前2 种色谱柱均无法有效分离5 种罂粟壳生物碱，且峰型差、响应较低，难以定性定量，而使用HILIC Core-shell柱则能达到较好的分离效果（图1C）。因此，选用HILIC Core-shell色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 µm）进一步优化HPLC流动相条件。

由于5 种罂粟壳生物碱易溶于甲醇或乙腈，实验分别考察了甲醇和乙腈作为强洗脱流动相的洗脱效果。当乙腈⁃水体系作为流动相时，在正离子模式下的洗脱效果和响应强度均优于甲醇⁃水体系，这有可能是因为待测物在甲醇中稳定性较差。因此，实验选择乙腈作为流动相。同时，这5 种罂粟壳生物碱都含较多羟基[24]，采用在流动相中加入体积分数0.1%的甲酸以提高待测物在正离子模式下的离子化效率，容易得到[M+H]+离子，提高灵敏度。

当使用体积分数0.1%甲酸-水溶液和体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相进行等度洗脱时，待测物有严重的拖尾现象，峰型差。尝试在体积分数0.1%甲酸-水溶液中加入一定的甲酸铵，发现可以有效改善峰拖尾、峰型差的问题。为了提高目标化合物的响应和定量精确度，进一步考察不同浓度甲酸铵对目标化合物离子化效率的影响。结果表明，在体积分数0.1%甲酸-水溶液中加入10 mmol/L甲酸铵能够有效增强目标化合物的响应值并改善目标峰峰型，而继续增加甲酸铵浓度反而降低了目标化合物的离子化效率。因此，实验选择含10 mmol/L甲酸铵的体积分数0.1%甲酸-水溶液和体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相。

2.2 质谱条件优化

根据5 种罂粟壳生物碱及2 种内标物质的化学结构，实验选择正离子模式。通过质谱模式，优化毛细管电压、脱溶剂气流速及温度等参数，使5 种罂粟壳生物碱及2 种同位素内标物质的母离子响应较高且稳定;采用Intellistart模式优化子离子的碰撞电压和锥孔电压，以获得较高的响应，选择离子丰度最高的子离子作为定量离子，离子丰度次高的子离子作为定性离子，各化合物的提取离子流色谱图见图2。

罂粟碱和蒂巴因与可待因分子结构较为接近，为降低成本，对空白基质样品前处理定容后，取定容液加标上机检测，通过相对误差比较2 种定量方式对结果的影响：可待因、罂粟碱、那可丁、蒂巴因用可待因-D3进行内标法定量，吗啡用吗啡-D3进行内标法定量（以下称方法1）[25];罂粟碱、那可丁、蒂巴因用外标法定量，可待因用可待因-D3、吗啡用吗啡-D3进行内标法定量（以下称方法2）。

由表2可知，采用方法1时，那可丁、罂粟碱、蒂巴因定量结果的相对误差显著小于方法2，说明方法1可以有效降低基质干扰，具有很好的校准效果，有利于提升定量准确性，从而提高目标物的回收率。因此，选取方法1进行定量分析。

2.3 前处理条件优化

2.3.1 提取试剂的选择

在试样中加入适量水有助于提高提取效率，这是因为水能够增强提取试剂的渗透能力，促进提取试剂渗透到基质较为复杂的肉制餐饮食品中，从而提高回收率。选用乙腈、甲醇、乙酸乙酯为提取试剂，回收率由低到高依次为乙酸乙酯、甲醇、乙腈，这可能是由于提取试剂极性越大，肉制餐饮食品试样中脂类等弱极性杂质溶解越少，从而提高回收率。

为研究酸碱对于提取效率的影响，实验对比不同体积分数的甲酸-乙腈溶液和氨水-乙腈溶液的回收率。由图3～4可知：在那可丁、罂粟碱、蒂巴因加标水平为2.0 μg/kg，可待因、吗啡加标水平为10.0 μg/kg时，随着甲酸体积分数的增加，除罂粟碱回收率基本不变外，其余4 种罂粟壳生物碱的回收率均呈先升高后降低的趋势，当提取液中甲酸体积分数为0.2%时，各目标化合物回收率最高;随着氨水体积分数的增加，5 种罂粟壳生物碱提取效率均呈先升高后降低的趋势，且均高于相同体积分数甲酸时各目标化合物的提取效率。这说明5 种罂粟壳生物碱在碱性条件下更易被提取。因此，选择体积分数0.1%氨水-乙腈溶液作为提取试剂。

2.3.2 净化方法的选择

肉制餐饮食品中含有大量的蛋白质、脂肪、磷脂和色素等物质[26]，成分复杂，这些组分的存在会产生基质效应，进而严重干扰目标化合物的测定，因此十分有必要对提取液进行净化。有研究[27]指出提取液经MCX柱吸附、洗脱后获得的净化效果较好。但是由于卤肉、羊肉汤等肉制餐饮食品中组成成分相对复杂，通过固相小柱时容易造成堵塞，洗脱困难，导致目标物损失，不利于提高检测效率。

PSA是一种极性吸附剂，同时含有伯胺和仲胺基团，具有弱阴离子交换能力，可有效去除脂类和糖类。C18可吸附提取液中的色素[28]，C18E是一种封尾的C18吸附剂填料，是疏水性最强的硅胶基吸附剂，其对非极性化合物具有出色的强吸附特性。因此，选用PSA和C18E作为净化剂，去除杂质干扰，同时加入适量无水硫酸镁去除提取液中残留的水分。移取2 mL待凈化上清液于定制的SPE净化管（2 g无水硫酸镁、50 mg PSA、100 mg C18E）中，涡旋30 s，4 000 r/min离心5 min，取上清液，用0.22 μm有机相滤膜过滤，检测结果表明杂质峰明显减少，并能获得满意的回收率。本实验采用QuEChERS法，直接将固相分散吸附剂加入提取液中净化，操作简便、快捷、高效。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线线性、方法LOD及定量限（limit of quantitation，LOQ）可待因、罂粟碱、那可丁、蒂巴因用可待因-D3进行内标法定量，吗啡用吗啡-D3进行内标法定量，以5 种罂粟壳生物碱与对应内标响应峰面积之比为纵坐标，各目标物质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。分别以3 倍和10 倍信噪比（RS/N）确定5 种罂粟壳生物碱的方法LOD和LOQ。

由表3可知，5 种罂粟壳生物碱在一定质量浓度范围内线性良好，线性相关系数均大于0.999，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[29]要求，能够满足肉制餐饮食品中5 种罂粟壳生物碱的快速检测。

卤肉、肉汤、骨汤膏3 种不同基质样品中5 种罂粟壳生物碱的方法LOD及LOQ如表4所示。由于骨汤膏中含有大量油脂和其他固形物，在一定程度上影响了检测灵敏度，骨汤膏的方法LOD和LOQ均高于与其他2 种基质样品，但以上3 种基质样品中5 种罂粟壳生物碱的方法LOD及LOQ均低于吴义春等[30]采用QuEChERS-UPLC-MS法测定酱卤肉中5 种罂粟壳生物碱的LOD和LOQ。

2.4.2 回收率及精密度

取阴性肉汤按1、2、10 倍LOQ 3 种水平加标，按照优化条件前处理后测定，平行测定6 次，计算回收率以及相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）。由表5可知，5 种罂粟壳生物碱的平均回收率为85.5%～107.4%，RSD为0.5%～4.7%，符合GB/T 27404—2008要求，能够满足肉制餐饮食品中5 种罂粟壳生物碱的快速检测。

2.5 实际样品检测

采用本实验方法对50 批次的肉汤、卤肉样品进行检测，每个样品做2 个平行，同时与DB 31/2010—2012作对比，2 种方法检出结果均为阴性，表明商场所售肉制餐饮食品中5 种罂粟壳生物碱检出风险较低。

3 结 论

本研究通过筛选色谱柱、优化提取溶剂、内标法定量、QuEChERS法净化等方法使目标物得以高效分离，建立了一种QuEChERS-UPLC-MS/MS法测定肉制餐饮食品中5 种罂粟壳生物碱的方法。该方法无需盐析、操作简便、高效快速，具有理想的回收率和精密度，很好地改进了检测食品，尤其是脂肪、蛋白含量较高，食品中基质效应大、灵敏度低等问题，吗啡、可待因LOD为1.5～2.5 μg/kg，罂粟碱、那可丁、蒂巴因LOD为0.3～0.5 μg/kg，有效保证分析结果的重复性和重现性，适用范围广，能够满足多种肉制餐饮食品中5 种罂粟壳生物碱的检测要求。实际样品检测结果表明，商场所售肉制餐饮食品中5 种罂粟壳生物碱检出风险较低。

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