新疆地区非综合征型聋患者耳聋相关基因检测结果分析

侯小娟 吴梅 丁伟 张伦 唐亮

听力损失是最主要的出生缺陷之一，严重影响患者的认知能力和交流能力，大大降低患者的生活质量。中国是世界上听力残疾人口最多的国家，我国有听力障碍人口高达2 780万之多，如此庞大的聋人数量，给社会以及聋人家庭都带来了非常严重的经济负担。通过分子生物学方法可检测出耳聋患者及其家属是否携带目前研究的耳聋热点基因,如GJB2、SLC26A4和mtDNA12SrRNA基因等[1，2],为耳聋患者(或潜在耳聋患者)及其家属提供用药、生活注意事项等的科学指导,还能为其提供遗传咨询、生育聋儿风险率评估、产前诊断、人工耳蜗植入疗效预测等的科学依据。

由于特殊的自然条件和民族传统，形成了新疆地区相对独立的遗传体系，同时，由于新疆地区特异的地域、环境以及饮食习惯，导致该地区耳聋的发病具有地域特点。但目前新疆地区对于耳聋基因的检测基本只包括GJB2基因(c.35delG，c.176_191del16，c.235delC，c.299_300delAT)、GJB3基因(c.538C>T)、mtDNA12SrRNA基因(c.1494C>T，c.1555A>G)、SLC26A4基因(c.2168A>G，c.IVS7-2A>G)共四个基因九个位点，以往对新疆地区非综合征型聋患者进行这四个基因九个位点筛查时检出率一般都低于20%[3～5]，还有很大比例的耳聋患者未找到相应的耳聋致病基因，提示有必要扩大筛查基因及位点的范围以更广泛的覆盖新疆地区受检人群。因此本研究拟通过增加GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA三个耳聋基因筛查位点，对新疆地区非综合征型耳聋患者进行检测，以便筛选出更多的耳聋基因突变热点，提高新疆地区耳聋基因检测工作的覆盖率，优化耳聋基因筛查策略。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2017年至2018经新疆自治区人民医院耳鼻喉诊疗中心确诊的非综合征型耳聋患者399例，其中男215例，女184例，年龄4个月～72岁，平均12.34±14.53岁，中位数6岁。汉族92例，维吾尔族273例，哈萨克族27例，回族7例。所有对象均进行纯音测听、听性脑干反应、声导抗以及畸变产物耳声发射测试；所有患者鼓室导抗图均为A型，耳声发射未引出，通过纯音测听以及听性脑干反应测试均诊断为双侧感音神经性听力损失，按听力损失分级标准：轻度(26～40 dB HL)，中度(41～60 dB HL)，重度(61～80 dB HL)，极重度(≥81 dB HL)，399例患者中轻度听力损失16例(4.01%)，中度听力损失40例(10.03%)，重度听力损失78例(19.55%)，极重度听力损失265例(66.42%)。

1.2耳聋基因检测

1.2.1使用Primer 5.0软件进行PCR位点的引物设计和合成，选择检测突变位点包括GJB2基因：c.35delG，c.167delT，c.176_191del16，c.235delC，c.299_300delAT；SLC26A4基因：c.281C>T，c.589G>A，c.IVS7-2A>G，c.1174A>T，c.1226G>A，c.1229C>T，c.IVS15+5G>A，c.1975G>C，c.2027T>A，c.2162C>T，c.2168A>G；mtDNA12SrRNA基因：c.1494C>T，c.1555A>G，c.1585A>G，c.1047A>G，c.1095T>C，c.960_961insC/c.961delT，引物信息见表1。

1.2.2采集399例非综合征型聋患者的外周静脉血2 ml于EDTA抗凝管中,利用基因组提取试剂盒(康为世纪全血DNA提取试剂盒)从300 μl患者全血中提取基因组DNA(内含线粒体DNA)；以基因组DNA为模板利用所设计引物进行PCR扩增、产物纯化和Sanger测序工作(测序仪为3130DX)，根据测序结果进行目标位点多态性的分析。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行数据处理，不同民族差异比较采用χ2检验，当有理论频数<5时，使用Fisher确切概率法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1399例对象耳聋基因检测结果 399例非综合征型耳聋患者GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA3个耳聋常见致病基因共筛查出阳性突变患者98例，突变携带率24.56%(98/399)，致病突变频率为12.78%(51/366)；其中GJB2突变携带率为11.28%(45/399)，致病突变频率为6.52%(26/399)，包括纯合突变22例，复合杂合突变4例。SLC26A4突变携带率为10.78%(43/399)，致病突变频率为3.76%(15/399)，包括纯合突变4例，复合杂合突变11例。mtDNA12SrRNA基因总突变携带率为4.76%(19/399)，致病突变频率为3.51%(14/399)(表2)。

表1 GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因引物序列信息

表2 3个耳聋基因突变位点及基因突变类型例数和突变携带率(例)

2.2GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因及各突变位点在不同民族中检出结果GJB2基因突变在回族中检出1例，在哈萨克族中未检出相关突变；SLC26A4基因突变在回族中检出1例，在哈萨克族中检出2例；在回族和哈萨克族中均未检测出mtDNA12SrRNA相关突变。由于回族和哈萨克族患者样本量较少，因此仅对汉族和维吾尔族进行统计学分析，GJB2基因、SLC26A4基因突变在汉族和维吾尔族中的检出率差异有统计学意义(均为P<0.05)，mtDNA12SrRNA基因突变两组之间差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因突变在汉、维族的检出例数及检出率(例，%)

在汉、维族中突变频率最高的位点都是GJB2基因的c.235delC，其次为SLC26A4基因的c.IVS7-2A>G。在汉族和维吾尔族中GJB2的c.235delC(χ2=9.498、P=0.002)、SLC26A4的c.IVS7-2A>G(χ2=8.729、P=0.003)、c.2168A>G(P=0.001)检出率差异均有统计学意义，其他突变位点在汉、维族中检出率差异均无统计学意义(表4)。

表4 GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA基因各突变位点在汉、维族的检出例数及检出率(例，%)

3 讨论

GJB2基因编码缝隙连接蛋白Cx26，并与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成通道，是电解质、第二信使和代谢产物在细胞间转换的重要通道[6]。纪育斌等[7]将我国近10年来与GJB2基因突变有关的流行病学文献相关数据进行总结，分析发现GJB2基因总体致病突变携带频率为19.41%，总体致病突变频率为12.88%，GJB2基因最常见的突变方式是c.235delC，其次是c.299_300delAT、c.176_191del16bp和c.35delG。本研究新疆地区399例非综合征型耳聋患者GJB2基因突变携带频率为11.28%，致病突变频率为6.52%，低于纪育斌等总结的数据，可能与新疆地区为少数民族聚居区有关，但主要突变位点一致，其中c.235delC突变率最高；而此次筛查中未发现c.167delT突变。

SLC26A4基因的突变会导致大前庭水管综合征(enlarged vestibular aqueduct, EVA)和Pendred综合征[8，9]。自从1997年被鉴定以来，在世界范围内已经发现500多种SLC26A4基因突变位点。SLC26A4基因突变具有等位基因异质性的特点，不同地域、种族其基因具有不同的突变谱[10～12]，c.IVS7-2A>G是中国人群中最常见的突变位点，且我国地域辽阔、民族众多，同一地区不同民族以及同一民族不同地区的基因突变阳性率都有差异[13]。本组对象SLC26A4基因总突变携带率为10.78%，致病突变频率为3.76%，其中c.IVS7-2A>G突变率为5.76%，c.1174A>T突变率为2.26%，c.2027T>A突变率为2.01%，c.2168A>G突变率为1.5%，c.1226G>A突变率为1.25%，c.1975G>C和c.589G>A突变率仅为0.5%和0.25%，未发现c.281C>T、c.1229C>T、c.IVS15+5G>A、c.2162C>T突变，后续耳聋基因筛查中在原有筛查位点c.IVS7-2A>G和c.2168A>G的基础上可考虑添加c.1174A>T和c.2027T>A突变位点。

线粒体基因突变是药物性聋的分子基础，在母系遗传的氨基糖苷类抗生素致聋家系中进行的线粒体基因组上的突变分析识别出多个mtDNA的突变位点，包括mtDNA12SrRNA基因的c.A1555G和c.C1494T[14]、c.T1095C、c.960_961insC、c.961delT等位点[15，16]。本课题组于2012年对乌鲁木齐地区609例耳聋患者及378例听力正常母系家庭成员进行药物性耳聋基因筛查，除了检测出上述mtDNA12SrRNA突变位点外，还发现了保守指数高达100%的c.A1047G，以及能够破坏mtDNA12SrRNA二级结构上原有配对且暂无报道的c.A1585G突变，这两种突变是否与耳聋相关，尚不清楚[17]，因此，本研究将这两个位点纳入了检测范围中，以期发现这两个位点的更多信息；通过检测发现c.1555A>G突变率为2.01%，c.960_961insC/961delT突变率为2.76%，c.1095T>C突变率为0.75%，c.1585A>G突变率为0.25%，未发现c.1494C>T和c.1047A>G突变。携带c.1585A>G突变的患者同时携带SLC26A4基因c.2027T>A突变，为大前庭水管综合征患者，因此，可排除c.1585A>G突变在该患者耳聋形成中发挥主要作用。针对mtDNA12SrRNA突变阳性患者及其家属进行宣教，使其母系家庭成员避免接触氨基糖苷类抗生素，可以有效预防药物性耳聋的发生和发展。

新疆作为多民族聚居区域，不同人群的迁移、各民族间婚配造成了较为广泛的基因交流，增加了该地区人群基因结构的复杂性，各民族耳聋基因突变也存在一定差异性。本研究通过对汉族和维吾尔族中GJB2、SLC26A4及mtDNA12SrRNA基因各位点突变率进行对比发现，汉族GJB2基因和SLC26A4基因突变检出率显著高于维吾尔族，而mtDNA12SrRNA基因突变在两个民族的检出率无显著差异；通过分析两个民族中各个耳聋基因突变位点的检出率发现，c.235delC和c.IVS7-2A>G均为两个民族中的热点突变；在汉族中c.2168A>G也为热点突变位点，而在维吾尔族中c.1174A>T、c.35delG、c.2027T>A等多个位点都呈现出热点突变位点的趋势，这种情况是否与不同民族起源与进化有关，有待进一步研究。在汉族中GJB2基因的c.235delC突变、SLC26A4的c.IVS7-2A>G和c.2168A>G突变的检出率显著高于维吾尔族，与戴朴等[18，19]研究结果一致，其他突变位点在两个民族中均无显著性差异。这些结果将有助于优化新疆地区非综合征型耳聋患者耳聋基因筛查的策略及检测方法，为因地制宜的制定耳聋基因检测方案提供依据。

本研究尚存在问题与不足，所采用的对特定突变位点的检测方法相对落后，不利于发现新的突变位点，也不利于提供准确的临床基因诊断，因此,后续研究中应系统的进行耳聋相关基因的全序列分析，有效的掌握本地区耳聋基因的突变类型及突变热点，为新疆地区不同民族的耳聋基因突变图谱的绘制提供依据。