一株高产胞外多糖乳酸菌的鉴定及其特性研究

张国华，张纬珍，梁武龙，王 伟，涂 建

（山西大学生命科学学院 太原030006）

传统发酵酸面团（Sourdough），在我国也称为老面、酵子、面肥或起子，是传统制作馒头或面包的主要发酵剂，其主要由小麦粉和水混合发酵而成，是酵母菌、乳酸菌、霉菌等多菌群组成的混合发酵体系[1-3]。酸面团在发酵过程中由于其含有多种微生物及各种化学酶系，因此伴随着一系列的生化反应，如酸化作用、蛋白质降解、胞外多糖和风味底物的生成等，使得面团物性特征发生变化，因而制备的发酵面制品感官品质更佳[4-6]。在酸面团发酵过程中，酵母菌主要将面粉中的糖类物质转化为CO2及醇、醛类等物质，形成稳定的面筋结构及独特风味[7-8]；乳酸菌则利用面团中可发酵糖，产生乳酸、醋酸及丙酸等有机酸，可与酵母发酵中产生的醇、醛等物质相互作用，形成新的风味物质，此外乳酸菌还能产生抑菌物质，如细菌素，可延长产品的保质期[8]。

由于酸面团制备的发酵食品口感细腻，风味独特且更有嚼劲，因此得到国内外许多专家学者的关注。如Dal Bello 等[9]研究证实酸面团中的旧金山乳杆菌（L.sanfranciscensis LTH 2581）和植物乳杆菌（L.plantarum FST 1.7）可有效增加面包体积，酸化面团及产生抗真菌因子，延缓面包瓤老化3 d 时间。Van Kerrebroeck 等[10]利用Meta-Analysis 对已报道的300 多个酸面团进行分析，从酸面团中微生物多样性角度分析酸面团可分为I型和II 型酸面团，在酸面团中酵母菌种的数量普遍低于乳酸菌种的数量。Martorana 等[11]通过对酸面团中乳酸菌和酵母菌的分离鉴定，得出旧金山乳杆菌和酿酒酵母为其中的优势菌种。国内孙银凤等[12]应用我国传统酸面团的区域特色乳酸菌——旧金山乳杆菌发酵酸面团，结果表明酸面团能够减少面包硬度增加量，降低水分迁移量和老化焓值，具有改善面包老化特性的效果。Zhang等[2]利用传统分离培养技术与变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法研究了来自中国不同地区的酸面团中微生物的多样性，最终分离并鉴定了131 种酵母菌、2 种霉菌和106 种乳酸菌菌株，结果发现旧金山乳杆菌是中国传统酸面团中的主要优势菌种。刘若诗等[13]研究发现冻干旧金山乳杆菌酸面团发酵剂对发酵面团和面包香气的影响显著，酸面团面包面团中有机酸和游离氨基酸含量均高于相应的非酸面团面包面团，乳酸菌酸面团发酵显著提高了面包中挥发性物质的含量。此外，乳酸菌产生的胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）对面制品有延缓老化，增加吸水性，维持结构，增加体积的作用，产生的抑菌物质有效抑制真菌与细菌的生长，从而延长面制品保藏时间[14]。如Tamani 等[15]研究发现产EPS 的乳酸菌具有抗面包老化的效果，而不产EPS 的乳酸菌对面包品质及老化无明显作用，其原因可能是乳酸菌在发酵过程中产生的EPS 增强面包保水性，进而改善面包品质及老化特性。

本文以实验室筛选的一株高产胞外多糖的乳酸菌菌株SXU-1001[EPS 产量为（190.32±2.36）mg/L]为研究对象，对其进行了系统研究，测定了该菌株的生理生化特性、产酸曲线、抑菌特性及药敏谱，为开发传统发酵食品中微生物资源奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

革兰氏染色液试剂盒HB8278，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。

3%过氧化氢溶液：取30%过氧化氢溶液10 mL，用水定容至100 mL 即可。

乳酸菌成套生化鉴定管：七叶苷1 支，纤维二糖1 支，麦芽糖1 支，甘露醇1 支，水杨苷1 支，山梨醇1 支，蔗糖1 支，棉子糖1 支，菊糖1 支，乳糖1 支，马尿酸1 支，无菌液体石蜡1 支，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

抗菌药物药敏纸片30 种，执行标准为WS/T 125-1999，杭州微生物试剂有限公司。

PHS-3C 型pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；SP-2000UV 紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；DSX-280B 型手提式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；YLY-XH-100AD实验室超纯水机，深圳市亿利源水处理设备有限公司；SC-3614 低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；OLYMPUS BX53 正置荧光显微镜，南京伊若达仪器设备有限公司；Nicolet IS 50 傅里叶变换红外光谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 菌种与培养基

乳酸菌SXU-1001 由本实验室提供。

mMRS 培养基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，牛肉浸粉10 g/L，麦芽糖20 g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸铵2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，吐温80 1 mL/L，pH 5.4。

营养琼脂培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂15 g/L，pH 7.2～7.4。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化与培养 将冻存于-20 ℃的乳酸菌SXU-1001 从冰箱中取出，于mMRS 肉汤培养基中活化2～3 次，然后于mMRS 琼脂培养基中划线培养，挑取单菌落于mMRS 液体培养基中纯化培养。

1.3.2 乳酸菌系统发育树的构建 将活化后的乳酸菌SXU-1001 使用细菌DNA 试剂盒提取其基因组DNA，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将得到的测序结果与NCBI 数据库进行同源性比对分析，找到同源性最接近的已知种属的序列。用软件MEGA 7.0 进行序列分析，并采用Neighbor-Joining 法进行系统发育分析，构建进化树，研究分离菌株与模式株之间的亲缘关系。

1.3.3 乳酸菌细胞形态观察 将乳酸菌SXU-1001 于培养箱中培养24 h，采用革兰氏染色法和芽孢染色法[16]对细菌形态进行观察，采用电镜观察细菌细胞结构，并进行图像采集。通过光学显微镜测量细菌的大小，通常使用放在显微镜中的显微测微尺来测量。细菌的长度单位为微米（μm），其个体大小的测定方法为：宽度×长度[17]。

将培养24 h 后的乳酸菌发酵液进行梯度稀释，选择适宜的梯度稀释液进行平板涂布，于培养箱中培养3～7 d 观察菌落形态，观察时选择菌落分布比较稀疏处于孤立的菌落。

1.3.4 红外光谱分析 将培养24 h 的乳酸菌经冷冻干燥后于傅里叶变换红外光谱仪中进行400～4 000 cm-1全范围扫描，分析吸收峰[17]。

1.3.5 乳酸菌生长量及生长曲线的测定

1.3.5.1 生长量的测定 采用细胞干重法，取乳酸菌发酵液（24 h）于9 000 r/min 条件下离心15 min，得到的菌体用去离子水清洗2 次，转入已称重的离心管中，在（100±5）℃烘箱中烘干至恒重，记录数值[18]。

1.3.5.2 生长曲线的测定 将分离纯化得到的乳酸菌按体积分数为1%的接种量于mMRS 培养基中，30 ℃培养48 h，测量不同时间段的吸光度值A600nm以及相对应时间的菌落数，分别以A600nm，lg（CFU/mL）为纵坐标、时间为横坐标，绘制乳酸菌的生长曲线。

对数期中3 个重要参数的计算[17]：

1.3.6 乳酸菌pH 值及产酸速率曲线的测定 将分离纯化后的乳酸菌按体积分数为1%的接种量接种到mMRS 肉汤培养基中，30 ℃培养48 h，测量不同时间段的pH 值，以时间为横坐标，pH 值为纵坐标绘制pH 值曲线。

产酸速率的测定：取10 mL 发酵样液加入50 mL 蒸馏水，用0.1 mol/L NaOH 溶液进行滴定，直至pH 值为8.2，对所用的NaOH 溶液的体积进行记录，计算总酸含量[19]。计算公式为：

式中：C——标准氢氧化钠浓度，mol/L；V——滴定消耗氢氧化钠的体积，mL；K——酸的换算系数，乳酸为0.090；V0——样品稀释液总体积，mL；m——样品体积，mL；V1——滴定时吸取的样液体积。

1.3.7 乳酸菌的生化鉴定 采用生化鉴定管对乳酸菌的生化特性进行鉴定，鉴定项目包括七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖、1%马尿酸钠。用接种环从平板上挑取已纯化培养的同一乳酸菌菌落于需要试验的生化管中，于30 ℃培养24～48 h，观察试验结果，若结果为黄色（除1%马尿酸钠生化鉴定管变为黑色之外）则为阳性，紫色为阴性。

将乳酸菌SXU-1001 接种于mMRS 琼脂斜面，于30 ℃培养48 h。将培养好的乳酸菌涂于干净的载玻片上，向载玻片滴加配制好的过氧化氢溶液，如果在半分钟内有大量气泡产生则为过氧化氢阳性反应，没有气泡产生则为过氧化氢阴性反应[20]。

1.3.8 乳酸菌的抑菌活性 采用纸片法[21]进行抑菌试验。分别将冻存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌划线于营养琼脂斜面，37 ℃培养24 h 进行活化待用。培养结束后，将3 种指示菌（1×108CFU/mL）均匀涂布在营养琼脂培养基上，将无菌的滤纸片（6 mm）贴在涂有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌的平板上，分别在每个滤纸片上滴加10 μL 乳酸菌SXU-1001 发酵液，37 ℃培养24 h，观察并计算抑菌圈直径 （单位：mm），以滴加等量的无菌生理盐水为对照组。

1.3.9 乳酸菌药敏谱 将乳酸菌SXU-1001 发酵液（1×108CFU/mL）均匀涂布在已凝固的mMRS 培养基上，待菌液干燥后，将30 种药敏纸片分别贴于培养基表面，30 ℃培养48 h 后观察并记录抑菌圈直径。若产生抑菌圈则表明该抗生素对乳酸菌的生长具有抑制作用，若无抑菌圈则表明乳酸菌的生长不受该抗生素的影响[22]。

1.4 数据处理

每组试验重复3 次，采用SPSS 15.0 软件对数据进行处理，所有结果均采用±s 表示，利用ANOVA 进行显著性分析（P＜0.05，P＜0.01）；采用Origin 8.5 对试验结果进行作图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌系统发育树

系统发育树也称系统进化树（phylogenetic tree），它是用类似树状分支的图来表示各种（类）生物之间的亲缘关系，通过对生物序列的研究来推测物种的进化历史。为明确乳酸菌SXU-1001的种属，本试验将乳酸菌SXU-1001 与传统酸面团中已报道的屎肠球菌 （Enterococcus faecium）、面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）[2]进行对比分析，建立的16S rRNA 系统发育树如图1所示，其中测试菌株SXU-1001 与旧金山乳杆菌的亲缘关系最近。此外，在与NCBI 数据库中比对分析得到乳酸菌SXU-1001 与旧金山乳杆菌JCM 5668 的相似性为99%。因此，可鉴定为旧金山乳杆菌，本实验室将其命名为旧金山乳杆菌Ls-1001。Ganzle 等[23]通过对世界范围内的酸面团分析得到酸面团中存在80 多种细菌，主要包括乳杆菌、明串珠菌、乳球菌、肠球菌和链球菌，其中旧金山乳杆菌是酸面团中的主要微生物（如图2所示）。

图1 乳酸菌SXU-1001 16S rRNA 系统发育树Fig.1 16S rRNA phylogenetic tree of LAB SXU-1001

图2 酸面团中典型的乳酸菌[23]Fig.2 Graphic representation on typical sourdough lactic acid bacteria[23]

2.2 旧金山乳杆菌细胞形态观察

如图3a 所示，旧金山乳杆菌Ls-1001 在mMRS 琼脂培养基上的菌落为白色，形状为规则圆形，具体描述见表1；经革兰氏染色结果（图3b）表明旧金山乳杆菌Ls-1001 为紫色，是革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，菌体大小（宽度×长度）为（1.28～ 1.60）μm ×（2.4～8.0）μm；经芽孢染色（图3c）后，旧金山乳杆菌Ls-1001 菌体呈现红色，并未有绿色出现，表明旧金山乳杆菌Ls-1001 不产芽孢；旧金山乳杆菌Ls-1001 在扫描电镜下的形态如图3d 所示，细菌呈现杆状，微弯曲，与先前Kline 等[24]报道的旧金山乳杆菌为短到中等细长杆或较短链，具有形成弯曲或丝状的较小倾向相一致。

图3 旧金山乳杆菌Ls-1001 的不同形态Fig.3 Different forms of L.sanfranciscensis Ls-1001

表1 旧金山乳杆菌Ls-1001 菌落形态描述Table 1 Description of colony morphology of L.sanfranciscensis Ls-1001

2.3 红外光谱分析

旧金山乳杆菌的傅里叶变换红外光谱分析结果如图4所示，吸收峰主要集中在3 300 ～2 900 cm-1和1 650～850 cm-12 个区域之间。据文献报道，微生物的FTIR 光谱通常分为5 个区域，这些区域包含来自不同细胞组分的信息：1）3 000～2 800 cm-1：细菌细胞膜中的脂肪酸；2）1 800～1 500 cm-1：来自蛋白质和肽的酰胺条带；3）1 500～1 200 cm-1：为含有蛋白质和脂肪酸的混合区域；4）1 200～900 cm-1：细胞壁内的多糖；5）900～500 cm-1：包含不属于特定官能团条带的“真实”指纹区域[25-26]。由此可知，旧金山乳杆菌细菌的细胞成分包括脂肪酸、蛋白质、多糖等物质。由于傅里叶变换红外光谱分辨率高，不仅能提供分子基团特征的振动吸收谱带，而且能敏锐地探测分子基团及其周围环境的变化[27]，因此在菌种的鉴定上有较多的应用。如Curk 等[26]通过FTIR 光谱法分析了53 株乳杆菌，在物种水平上正确率为94%，菌株水平上正确率为91%。Dziuba 等[28]通过使用人工神经网络 （ANN）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）在属水平上鉴定了乳酸菌和丙酸细菌。Dziuba 等[29]应用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和聚类分析（cluster analysis）对乳杆菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌和链球菌进行了鉴定。Srivastava 等[30]利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）进行了筛选。

2.4 旧金山乳杆菌生长量及生长曲线的测定

图4 旧金山乳杆菌傅里叶变化红外光谱分析Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）analysis of L.sanfranciscensis

旧金山乳杆菌Ls-1001 培养24 h 后的生长量测定结果如表2所示，为（24±1）g/L。细菌生长曲线反映了单细胞微生物在一定环境条件下的群体生长规律，依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。各时期的长短因菌种遗传特性、接种量、培养基和培养条件不同而有所改变[31]。观察图5中旧金山乳杆菌Ls-1001 在不同时间的吸光度值和菌落数的对数值可知，旧金山乳杆菌Ls-1001 在48 h 内只出现延滞期（0～4 h）、对数期（4～12 h）、平稳期（12～48 h），未出现衰亡期。经过对细菌生长对数期的计算可知旧金山乳杆菌Ls-1001 的繁殖代数（n）为0.36，生长速率常数（R）为0.045，代时（G）为22.42 min。通过测定旧金山乳杆菌的生长量和生长曲线，可了解细菌的生长规律，对于今后的科研以及改善传统发酵面制品的生产工艺具有重要的指导意义。

表2 旧金山乳杆菌Ls-1001 生长量的测定Table 2 Determination of the growth of L.sanfranciscensis Ls-1001

图5 旧金山乳杆菌Ls-1001 的生长曲线Fig.5 Growth curve of L.sanfranciscensis Ls-1001

2.5 旧金山乳杆菌pH 值及产酸速率曲线的测定

由图6可知，旧金山乳杆菌Ls-1001 在生长过程中pH 值呈逐渐下降趋势，在前15 h 下降较快，原因可能是菌数增加，旧金山乳杆菌的生长处于对数期，产酸较多；之后pH 值基本保持不变，pH 最终为4.09±0.01。由图7可知，旧金山乳杆菌Ls-1001 在生长过程中产酸量不断上升，15 h 之前总酸度上升速率快，之后产酸量缓慢增加最终趋于平稳，最终产酸量为（0.70±0.01）g/L。旧金山乳杆菌在生长过程中产生的一系列酸如乙酸、乳酸等都导致了pH 值的下降，据Corsetti 等[32]报道旧金山乳杆菌产生的混合酸中的己酸是具有最高抗霉菌活性的有机酸。此外，Moroni 等[33]提到由旧金山乳杆菌 （L.sanfranciscensis）CB1 产生的由己酸、乙酸、甲酸、丙酸、丁酸和正戊酸组成的混合物在抑制面包中的镰刀菌、青霉菌、曲霉菌和念珠菌生长中起关键作用。因此，由于旧金山乳杆菌具有产酸性能，故其在发酵面制品中的添加能防止或减少面制品微生物的腐败，进而提高面制品的保质期。

2.6 旧金山乳杆菌的生化鉴定

旧金山乳杆菌的生化鉴定结果如表3所示，在上述12 种生化鉴定中麦芽糖发酵管为阳性，表明旧金山乳杆菌可利用麦芽糖，与文献报道旧金山乳杆菌以麦芽糖为碳源相一致[34]；蔗糖发酵管既有阳性也有阴性结果出现，原因是不同旧金山乳杆菌菌株之间具有差异性，对蔗糖的利用程度不一致；其余10 种发酵管均为阴性，表明旧金山乳杆菌过氧化氢酶为阴性，在生长代谢过程中不能利用七叶苷、纤维二糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、棉子糖、菊糖、乳糖、1%马尿酸钠等物质。

2.7 旧金山乳杆菌的抑菌活性

由表4和图8可知，旧金山乳杆菌Ls-1001对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌均有抑制作用，抑菌效果为金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞白色念珠球菌。生理盐水（对照组）对3 株指示菌的生长无抑制作用。

图6 pH 值曲线Fig.6 The curve of pH

图7 产酸速率曲线Fig.7 Acid production rate curve

表3 旧金山乳杆菌的生化特性Table 3 Biochemical characteristics of L.sanfranciscensis

表4 旧金山乳杆菌Ls-1001 抑菌试验结果Table 4 Results of antibacterial experiment of L.sanfranciscensis Ls-1001

图8 旧金山乳杆菌Ls-1001 抑菌试验结果Fig.8 Results of antibacterial experiment of L.sanfranciscensis Ls-1001

2.8 旧金山乳杆菌的药敏谱

通过旧金山乳杆菌Ls-1001 药敏性试验研究表明，在测试的30 种抗生素中，各个抗生素对旧金山乳杆菌的影响有所不同，抑菌结果如表5所示。结果发现其中氨基糖苷类（庆大霉素、卡那霉素、新霉素、丁胺卡那）、喹诺酮类（诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星）、糖肽类（万古霉素）、硝基呋喃类（呋喃唑酮）这4 类抗生素均无抑菌圈出现，表明这4 类抗生素对旧金山乳杆菌的生长无抑制作用；而头孢类（头孢曲松、头孢哌酮、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢呋辛、头孢他啶）、大环内酯类（红霉素、麦迪霉素）、林可酰胺类（克林霉素）、青霉素类（青霉素、苯唑西林、氨苄西林、羧苄西林、哌拉西林）、四环素类（四环素、多西环素、米诺环素）、脂肽类（多黏菌素B）、磺胺类（复方新诺明）、酰胺醇类（氯霉素）这8 类抗生素均产生了大小不一的抑菌圈，表明这8 类抗生素能在不同程度上抑制旧金山乳杆菌的生长。由于旧金山乳杆菌是一种有益菌，其不仅对面团流变学特性及产品质地特性发挥着积极的作用，且乳酸菌在发酵过程中产生的一些具有生物活性的成分如胞外多糖，不仅广泛应用于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及保湿等，还具有保护菌体、抗肿瘤、促进免疫系统等作用[35]。因此，若旧金山乳杆菌应用于生产生活中，应考虑其与抗生素之间的相互作用及临床反应。乳酸菌菌株的耐药性评价是目前国际上益生乳酸菌安全性评价的首要内容[22]。通过研究旧金山乳杆菌对抗生素的敏感性，不仅完善了旧金山乳杆菌的基本性质，建立了相应的数据库，也为今后菌株的开发应用提供了支持。

表5 旧金山乳杆菌Ls-1001 药敏谱Table 5 L.sanfranciscensis Ls-1001 susceptibility spectrum

3 结论

本文对实验室保藏的分离自传统酸面团中一株高产胞外多糖的乳酸菌SXU-1001 菌株进行了鉴定，结果表明该乳酸菌为旧金山乳杆菌，是传统发酵酸面团中的优势菌种，本菌种为革兰氏阳性，过氧化氢酶为阴性，细菌形态呈杆状且微弯曲。经过傅里叶变换红外光谱分析，旧金山乳杆菌吸收峰主要集中在3 300～2 900 cm-1和1 650 ～850 cm-12 个区域之间，表明该细菌的细胞成分包括脂肪酸、蛋白质、多糖等物质。此外，旧金山乳杆菌的生物量为（24±1）g/L，繁殖代数为0.36，生长速率常数为0.045，代时为22.42 min，在生长过程中具有产酸现象的发生，其中pH 值最低为4.09±0.01，总酸度最高为（0.70±0.01）g/L，能利用麦芽糖，不同菌株对蔗糖的利用程度具有差异性。对3 种致病菌的抑菌效果为金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞白色念珠球菌，且在测试的30 种抗生素中对旧金山乳杆菌的影响各有不同。通过对旧金山乳杆菌基本特性的研究，为后续研究提供了参考依据，也为传统面食发酵剂中乳酸菌资源开发奠定了基础。