用DNA 条形码鉴定常见鱼翅的种类与真伪

熊娟，黄启红，陈敏儿，方军

（广东省科学院，广东省测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东省保健食品功效成分检测与风险物质快速筛查工程技术研究中心，广东 广州 510070）

广东省素被誉为养生大省，而鱼翅作为广东著名的养生保健佳品，一直深受人民的喜爱，价格一度水涨船高。市场流通多为加工后的干鱼翅制品，但鲨鱼种类繁多，相似物种之间外观形态差异小，传统形态学鉴定难以保证干鱼翅制品标识的准确性[1-3]，不良商家以次充好，更有不法生产者从濒危鲨鱼上采集鱼翅。本文建立的鱼翅DNA 条形码技术能更好地规范广东省鱼翅市场标识乱象，进一步保护濒危鲨鱼[4]。

DNA 条形码技术是利用生物体线粒体DNA 中一段保守片段对物种进行快速而准确的分子生物学鉴定[5,6]。2005 年，国际已开始合作实施鱼类生命条形码计划（FISH-BOL），该计划以电子数据库形式构建含有DNA 条形码图像和地理坐标的全球鱼类参考标准数据库[7,8]。Ward 等[7]利用条形码方法分析了澳大利亚超过200 种海洋鱼类和印度洋沿岸35 种鱼类，表明南非与澳洲海域的鱼类之间存在较大差异，地域群系之间种内差异性显著。N-J 进化树分析结论表明，能够使用线粒体细胞色素氧化酶亚基I（Cytochrome Oxidase subunit I，COI）作为海洋鱼类的DNA 条形码标准序列[9]。

本研究中，鱼翅制品属致密结缔组织，含有丰富的硫酸多糖，去除多糖一直是DNA 提取面临的主要难题。传统提取方法获得的DNA 纯度低，往往造成后续分子生物学实验失败，所以高效的提取鱼翅DNA 是整个实验顺利进行的前提。本研究比较了传统DNA 提取法和不同DNA 试剂盒提取法，以获取适合干鱼翅制品的方法，保证后续实验顺利进行。提取后的干鱼翅制品DNA 经过扩增、测序、进化分析，以证明该DNA 条形码方法对广东省干鱼翅制品鉴定的适用性。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用鱼翅均由广州市海味干果行业商会提供，其中用于DNA 提取效果研究的6 种鱼翅为市面上常见的正品鱼翅，并从形态学上进行物种鉴定，确保品质正宗，物种明确，包括：20 沙青片（低鳍真鲨Carcharhinus leucas）、蝶勾（尖齿柠檬鲨Negaprion acutidens）、牙勾（大青鲨Prionace glauca）、8寸五羊勾（丝鲨Carcharhinus falciformis）、10 上勿骨勾（浅海长尾鲨Alopias pelagicus）和白蝉片（尖吻斜锯牙鲨Rhizoprionodon acutus）。鉴定后的鱼翅作为标准样品，用于后续实验研究。用于鱼翅DNA 条形码研究的35 种鱼翅来源于广东省市场流通鱼翅，其中2 种是以明胶为主要原料制作的假鱼翅，为阴性对照。

利用经典CTAB 法、广州双螺旋生物科技有限公司生产的动物组织基因组DNA 提取试剂盒和QIAGEN 公司生产的DNeasy mericon Food Kit 试剂盒提取正品鱼翅DNA，采用广州维伯鑫生物科技有限公司生产的鱼源性（fish）核酸检测试剂盒（荧光-PCR 法）检测DNA 提取效果。

鱼翅COI 通用引物参考Ward 等[9]筛选出的DNA 条形码通用引物，对提取的样品鱼翅DNA 进行PCR 扩增，目的片段为COI 基因靠近5’末端，长度为680 bp 左右的序列，引物序列为：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’，5’-TAGACTTC TGGGTGGCCAAAGAATCA-3’。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测定后序列在BOLD（http://www.Boldsys tems.org）以及NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）网站的数据库进行鉴定以及相似度分析，并采用Mega 6.06 构建相应COI 序列的N-J 进化树、DNAMan 构建相应COI 序列的聚类同源树。

1.2 仪器与设备

高速台式离心机，5418R，德国Eppendorf；基因扩增仪，L96G，杭州朗基；荧光定量PCR 仪，7500，Applied Biosystems；微量移液器，1 000 μL、200 μL、100 μL、10 μL，德国Eppendorf；生物安全柜，BSC-100011B2，苏净安泰；凝胶成像系统，WD-9413B，北京六一。

1.3 方法

1.3.1 实验材料预处理

用灭菌二次水充分清洁干鱼翅样品表面，并用95%的酒精轻柔擦拭鱼翅表面，清除鱼翅表面的杂质与灰尘，在烘箱内烘干；用灭菌手术剪刀剪下约50 g 鱼翅样品，尽量剪碎放入研磨机中，20 000 r/min 研磨20 min，观察样品粉碎情况。

1.3.2 DNA 提取

经典CTAB 法参照《参考分子克隆》[10]动物DNA 提取方法，动物组织基因组DNA 提取试剂盒和DNeasy mericon Food Kit 均参照商品说明书。

用鱼源性（fish）核酸检测试剂盒分析提取DNA的纯度。25 μL 的反应体系，其成分包括：20 μL 的fish 反应液，酶液1 μL，样品DNA，阴性质控和阳性质控各4 μL。设置反应程序为：Holding Stage 95 ℃10 min，1 个循环；Cycling Stage 为95℃15 s，55 ℃1 min，40 个循环，并收集荧光信号。

1.3.3 DNA 条形码PCR 反应体系

以提取的DNA 为模板进行PCR 扩增。25.0 μL PCR 反应体系如下：10x PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL、模板用量根据PCR 扩增情况而变化，加水补至25 μL。

PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，35 个循环；72 ℃延伸5 min。

1.3.4 DNA 条形码PCR 产物分析

用琼脂糖凝胶电泳检测获得的样品DNA 条形码PCR 产物，将在680 bp 位置有条带的PCR 产物送至上海生工公司进行测序和序列拼接，获取680 bp 左右的COI 序列。

搜索BOLD 以及NCBI 网站的数据库,鉴定样品的COI 序列，比对分析相似度，根据比对结果，自NCBI 中下载相关鲨类物种COI 序列。将整理后的样品DNA 序列和GenBank 下载的相关序列应用MEGA 6.0 软件进行多序列比对，基于邻接法（N-J）构建进化树，选用K2P 替代模型，Bootstrap 自展检测1000 次。同时应用DNAMan 构建相应COI 序列的聚类同源树。

2 结果与分析

2.1 DNA 提取及效果分析

根据鱼源性（fish）核酸检测试剂盒（荧光-PCR法）说明书，扩增阈值（CT）≤40 判定为检出鱼源性，表示提取鱼翅DNA 成功；CT＞40 判定为未检出鱼源性，表示提取鱼鱼翅DNA 失败。同一扩增条件下，CT 值越小，表示初始扩增模板浓度越高；CT 值越大，表示初始扩增模板浓度越低。结果显示，经典CTAB 法提取成功3 个样品，动物组织基因组DNA提取试剂盒提取成功5 个样品，DNeasy mericon Food Kit 试剂盒提取成功6 个样品（表1）。样品3 采用经典CTAB 法提取DNA 的CT 值小于动物组织基因组DNA 提取试剂盒提取DNA 的CT 值；而采用DNeasy mericon Food Kit 提取DNA 的所有样品CT 值均小于采用经典CTAB 法和动物组织基因组DNA 提取试剂盒提取的DNACT 值，说明DNeasy mericon Food Kit 提取的DNA 浓度明显高于另外两种方法提取的DNA 浓度。

2.2 DNA 条形码获取序列比对结果

根据研究结果，采用DNeasy mericon Food Kit的方法提取DNA。通过PCR 扩增和测序，有5 个干鱼翅样品（sample11、sample28、sample31、sample34和sample35）无法扩增成功，其中sample34 和sample 35 为明胶制品，所以无法扩增出目的片段。而sample11、sample28 和sample31 用鱼源性（fish）核酸检测试剂盒检测阈值均＞40，可能原因是在干鱼翅的加工过程中DNA 严重降解，无法提取足量的DNA 进行后续研究。

本研究获得了30 个鱼翅个体的线粒体COI 基因序列。该序列是位于COI 基因5’端一段约为680 bp 的片段。将获得的COI 序列进行数据库比对及聚类分析鉴定，鉴定结果如表2 所示。30 个鱼翅分别来源于13 种鲨鱼物种：低鳍真鲨Carcharhinus leucas、大青鲨Prionace glauca、尖吻鲭鲨Isurus oxyrinchus、尖吻斜锯牙鲨Rhizoprionodon acutus、路氏双髻鲨Sphyrna lewini、Glaucostegus cemiculus（犁头鳐科）、丝鲨Carcharhinus falciformis、无沟双髻鲨Sphyrna mokarran、尖齿柠檬鲨Negaprion acutidens、舒氏星鲨Mustelus schmitti、高鳍真鲨Carcharhinus amboinensis、浅海长尾鲨Alopias pelagicus、沙拉真鲨Carcharhinus sorrah。从样品来源分析得出：6 个样品来源于大青鲨，5 个样品来源于丝鲨，4 个样品来源于尖吻斜锯牙鲨，4 个样品来源于路氏双髻鲨，其他样品的来源比较零星分散，说明市面上的鱼翅多采用大青鲨、丝鲨、尖吻斜锯牙鲨和路氏双髻鲨加工而成，偶有其他种类的加工制品；从分类阶元分析得出：4 种来源于真鲨属，7 种来源于真鲨科，10 种来源于真鲨目，说明真鲨目的鱼类适合于加工鱼翅制品，其中又以真鲨科真鲨属的鱼类采用的最多。这13 种鲨鱼物种基本涵盖市面上常见的鱼翅物种，从NCBI 中下载这13 种鲨鱼物种相似度达97%的基因序列共32 条，另外下载市面常见鱼翅物种Isurus paucus（长鳍鲭鲨，鲭鲨属、鲭鲨科、鲭鲨目）基因序列2 条，共计64 尾鲨鱼基因作为日常实验室检测的基因库。

表1 不同方法获得的DNA 浓度比较结果Tab.1 The comparison of DNA concentration obtained by different methods

2.3 构建进化树和同源树

构建64 尾鲨鱼基因的分子系统发育树显示（图1），同一个物种的不同个体基本都能形成单系，节点支持率大都为99%～100%，但同科聚类效果不是很明显。如真鲨目中，真鲨科的7 种物种和双髻鲨科的2 种物种节点支持率仅为78%。而不同目间的遗传距离明显更大，这与传统的鲨鱼分类学结果一致，证明了鲨鱼线粒体COI 基因种内具有高度的保守性，种间具有明显的差异性。

同时进行的64 尾鲨鱼基因聚类分析显示（图2），同一物种都位于同一分支，且不同个体的鱼类的COI 序列相似度均大于95%，说明DNA 条形码技术鉴别鱼类较为准确，不随个体有较大的变化；不同鱼类物种相似度各不相同，其中真鲨科和双髻鲨科的属间相似度均为89%，而真鲨目三个属间的相似度为87%，分类阶元越高，相似度逐渐下降，最低相似度为76%。构建的同源树不仅能反应不同鱼类的亲缘关系，还能直接看出不同鱼类COI 序列的相似度，表明亲缘关系较近的物种，特别是聚类到一个种类的物种可以通过DNA 条形码技术进行鉴别。

3 讨论

本文采用经典CTAB 法和试剂盒提取不同鱼翅制品的DNA。一般采用微量核酸蛋白测定仪定量分析DNA 来检测DNA 的纯度，但并不能完全反映DNA 中的杂质，需要采用凝胶电泳进一步确认，过程相对繁琐，准确度较低。本文通过鱼源性（fish）核酸检测试剂盒测定提取DNA 的阈值，分析出提取DNA 的浓度，直接分析目的基因的浓度，排除其他因素的干扰[11,12]。实验结果表明：DNeasymericon Food Kit 提取的DNA 含量明显高于另外两种方法提取的DNA 含量，更适合作为本实验中鱼翅的提取方法。

近年DNA 条形码技术在海洋鱼类的鉴定上也取得了较好的鉴定效果，但鉴定对象多为新鲜或是冰冻鱼类。这些鱼类大多细胞组织保存完好，而针对市售鱼翅的DNA 条形码鉴定鲜有报道[13-18]。广东省做为鱼翅制品销售流通的大省，对鱼翅标识需要更完善和更精确的鉴别技术。本研究在35 种市场流通鱼翅中，获得了30 个鱼翅个体的线粒体COI基因序列，在实验过程中不可避免出现扩增失败的情况，原因可能是DNA 在鱼翅制品加工过程中发生了降解[19]。通过NCBI 比对，选取基因序列相似度达到90%以上的物种作为同源物种。统计结果显示，30 个鱼翅分别来源于13 种鲨鱼物种。

表2 不同鱼翅在NCBI 数据库的鉴定结果Tab.2 Identification results of different sharks in the NCBI database

图1 64 尾鱼翅的COI 序列N-J 进化树Fig.1 Neighbor Joining tree based on COI sequences of sixty-four sharks

图2 64 尾鱼翅的COI 序列的聚类同源树Fig.2 Homology tree based on COI sequences of sixtyfour sharks

对于物种序列同源性较高的COI 序列，DNA 条形码技术推荐采用基于遗传距离的Neighbor Joining法构建进化树[20,21]。这种方法处理较多的COI 序列时，速度较快并能反映出物种间的亲缘关系。本研究获取的序列同源性比较高，大多为真鲨目和鲭鲨目物种，仅有一例为犁头鳐科鳐形目。本实验同时采用的聚类同源树分析显示：同种鱼翅样品的序列因分类亲和性而与相关参考序列聚在一起，形成一个聚类关系，以此可根据NCBI 中参考序列的物种信息确定样品所属分类。由此可以得出结论：本实验建立的DNA 条形码方法适用于鱼翅制品的鉴定研究，且大多可以鉴定到种的水平。