促甲状腺激素受体调控动物季节性繁殖的研究进展

夏 青 张仁森 李华振 王凤艳 王翔宇 魏彩虹 贺小云 储明星 狄 冉

(中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所/农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193)

最初，促甲状腺激素受体(Thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR)在狗甲状腺组织中发现，且在很长一段时间里研究者们认为TSHR基因只在动物甲状腺组织中表达。随着研究的深入，发现TSHR基因在动物多个组织广泛表达，并且甲状腺和胸腺TSHR主要参与人类格雷夫斯病(Graves’ disease, GD)发病机制调控[1-3]。近年来，国内外许多学者研究发现下丘脑TSHR基因与动物季节性繁殖行为具有较强的相关性[4-10]。下丘脑TSHR与促甲状腺激素β亚基(Thyrotrophin β subunit, TSHβ)结合间接刺激甲状腺激素(Thyroid hormone，TH)分泌，刺激下丘脑-垂体-性腺轴，以此调控季节性繁殖活动[11]。卵巢TSHR还可调控卵泡颗粒细胞增殖[12]。因此，TSHR是动物季节性繁殖的重要调控基因之一。本文根据实验室前期的试验结果，发现TSHR基因在绵羊中受到强烈选择。因此，本文就TSHR的基本特征尤其是它对动物季节性繁殖和卵巢功能的调控最新研究情况进行阐述，为更好更深入的研究TSHR基因提供理论基础。

1 TSHR的基本特征

1.1 TSHR基因及其表达蛋白结构

TSHR基因及其编码的蛋白在动物中具有高度保守性。不同动物TSHR基因位于不同染色体。例如绵羊位于7号染色体，鸡位于5号染色体，人位于14号染色体，但绝大部分物种TSHR基因具有10个外显子[8,13-14]。哺乳动物(人、绵羊和大鼠)及非哺乳动物(鹅、鸡)TSHR基因均编码约760个氨基酸的跨膜蛋白。TSHR蛋白属于糖蛋白激素受体亚家族[6,15-16]，具有7个跨膜结构，膜外结构与膜内结构各自形成3个环，分为膜外、跨膜和膜内区3个部分。TSHR胞外区主要由11个亮氨酸富集重复序列(Leucinerich repeat，LRRs)组成[17]。胞外区结构有多个TSH结合位点，也包含了TSHR自身抗体的主要结合位点[18]。TSHR的主要功能是与TSH结合，活化G蛋白-腺苷酸环化酶-cAMP和磷脂酶信号系统，激活G蛋白耦联，引发细胞内级联反应，促进甲状腺激素的合成、分泌和甲状腺细胞的生长，是脊椎动物垂体-甲状腺轴的重要组成部分[19]。

1.2 TSHR在动物体内的表达

TSHR基因最初从犬甲状腺中克隆得到[20]。起初，研究者认为TSHR仅在甲状腺中表达，随着研究不断深入，在越来越多非甲状腺组织中发现TSHR表达。例如，在小鼠眼眶后组织、下丘脑、垂体、淋巴细胞、棕色脂肪组织和红细胞中发现TSHR存在[21]。人垂体前叶细胞、十二指肠成纤维细胞、骨细胞、肝细胞、神经细胞和星形胶质细胞中也有TSHR的表达[22]。动物脑部TSHR的表达主要集中在下丘脑室管膜细胞(Ependymal cell, EC)和垂体结节部(Pars tuberalis, PT)区域[23]。Hazlerigg等[24]发现绵羊下丘脑正中隆起、室管膜室旁核、第三脑室、垂体、子宫和卵巢等组织均有TSHR表达。

对欧洲黑鲈的研究显示，TSHR表达在黑鲈卵子和精子复生过程中呈现明显的季节性变化，TSHR参与雌性黑鲈卵黄生成以及调节配子成熟和排卵；对雄性黑鲈而言，TSHR可能涉及早期性腺发育的调节以及配子成熟和排精过程[25]。另外，哺乳动物卵巢中也存在TSHR的表达，这种TSHR在卵巢上的表达可能与调节卵巢的功能有关。例如，雌性兔生殖器官中广泛存在TSHR[26-27]。牛成熟黄体中存在TSHR蛋白，推测它参与孕激素合成的局部调节[28]。TSHR在大鼠卵巢中也发挥作用，且大鼠颗粒细胞TSHR存在高表达[29]。人TSHR在卵巢表皮以及原始、初级和次级卵泡中高表达，用TSH刺激颗粒细胞，培养2 h发现cAMP浓度显著增加，表明cAMP浓度受TSHR激活调控。这些数据表明TSHR可能对卵巢有调节功能，TSHR信号转导的失调可能导致卵巢肿瘤发生[12,30]。有研究报道发现TSHR在各种硬骨鱼性腺中发挥作用[25,31]。这些数据表明TSHR对卵巢发育和动物的繁殖有调节功能。

2 TSHR对卵巢功能的调控

目前，关于TSHR基因对卵巢作用机制的研究多集中在大鼠和人上。大鼠垂体分泌的促性腺激素(促黄体素(Luteinizing hormone，LH)和促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，FSH))作用于卵巢，LH和FSH可驱动cAMP级联反应上调TSHR表达，卵巢分泌高浓度的雌二醇(β-Estradiol，E2)抑制TSHR表达[28]。大鼠卵母细胞分泌甲状腺刺激素(Thyrostimulin)作用于卵泡颗粒细胞，卵泡颗粒细胞表达的TSHR接受甲状腺刺激蛋白信号，并与相关Gα蛋白(例如Gαs)相互作用，刺激腺苷酸环化酶(AC)开启cAMP依赖性途径。研究发现上述途径在人卵巢通过复杂的串联通路，激活环状AMP反应元件结合蛋白(Cyclic AMP-responsive element binding protein, CREBP)、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)和AKT丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT serine/threonine kinase,AKT)通路，导致上述3种蛋白质磷酸化水平增加[12]。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)抑制剂可有效消除AKT和ERK的磷酸化，并促进甲状腺刺激蛋白引起的细胞增殖，提示上述通路对颗粒细胞增殖具有促进作用。cAMP和蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)结合激活PKA，可刺激编码P450芳香化酶和LHR转录，同时激活有丝分裂和卵泡液形成，使颗粒细胞中LHR和FSHR表达增加[12, 29]。

在兔卵巢表面上皮以及原始、初级和次级卵母细胞中观察到了TSHR、TRα1和TRβ1强免疫染色，而次级卵泡颗粒细胞中染色最弱。窦状卵泡颗粒细胞表达TSHR、TRα1和TRβ1蛋白[32-33]。Wakim等[34]发现人黄素化颗粒细胞含有高亲和力的甲状腺激素结合位点。卵巢外组织分泌的甲状腺激素可作用于卵巢表面及颗粒细胞的甲状腺激素受体，参与卵巢表面上皮的激素调节。

此外，有研究发现人成熟卵母细胞含有TRα和TRβ，卵泡液中存在DIO2、DIO3、T3和T4。这表明卵巢中存在DIO2与DIO3相互转化并刺激T3和T4相互转化的作用机制，同时T3可能直接作用于卵母细胞[33-36]。综上所述，TSHR对卵巢调控机制如图1所示。

图1 TSHR对卵巢功能的调控[12,27]

3 TSHR对动物季节性繁殖的调控

3.1 TSHR对绵羊季节性繁殖的调控

下丘脑的TSHR参与调节鸟类和哺乳动物的季节性繁殖[37-38]。下丘脑室管膜细胞(Ependymal cell, EC)连通垂体门脉系统和第三脑室脑脊液(Cerebrospinal fluid，CSF)，与下丘脑GnRH神经元形成突触连接。CSF中存在大量褪黑素(Melatonin，MT)，其浓度随光周期而变化，TSHR可能通过感知MEL浓度变化，通过一系列信号转换调节下游GnRH分泌，进而影响动物季节性繁殖活动[39]。Kijas等[4]使用绵羊SNP50芯片对世界各地74个品种2 819只绵羊进行扫描，发现与生长和繁殖有关的基因TSHR受到选择。Fariello等[5]对Kijas等研究者获得的相关数据进一步分析，推测绵羊驯化历史进程中TSHR基因突变可能导致绵羊由季节性繁殖向常年繁殖转变。同时国内的许多研究结果均提示TSHR基因与绵羊季节性繁殖性状具有较强的相关性[6-10]。

其中TSHR参与绵羊的详细季节性繁殖机制如下：外界长光照信号经过绵羊脑部一系列转化，刺激PT内眼缺失基因3(Eyes absent 3,EYA3)表达变化，EYA3可与正弦相关同源盒1(Sine oculis-related homeobox 1, Six1)、促甲状腺胚胎因子(Thyrotroph embryonic factor, Tef)及肝白血病因子(Hepatic leukemia factor, HLF)共同组成复合体与TSHβ 启动子结合促进PT内TSHβ的表达[11]。TSHβ与下丘脑TSHR结合[40]，促进第二信使环状单磷酸腺苷(Cyclic AMP, cAMP)表达，这种正反馈途径进一步增加PT内TSHβ表达[41-42]。Ono等[43]发现TSHR敲除(TSHR-KO)小鼠与正常小鼠相比PT内TSHβ表达水平降低，暗示TSHR可能通过正反馈回路刺激PT内TSHβ表达。绵羊TSHR与TSHβ结合刺激EC内DIO2表达[3,44]，进而刺激三碘甲状腺原氨酸(Triodothyronine, T3)与四碘甲状腺原氨酸(Tetraiodothyronine, T4)相互转化，高浓度的T3抑制性腺轴的活性，此时绵羊进入休情状态[45-46]。TSHR参与绵羊的季节性繁殖机制图见图2。

图2 TSHR调控绵羊的季节性繁殖机制

3.2 TSHR对禽类季节性繁殖的调控

鸟类与哺乳动物的季节性繁殖的分子机制虽有不同之处，但在涉及TSH参与的季节性繁殖通路上是保守的：TSHR与TSHβ相互作用间接调控T3浓度，T3作用于性腺轴调节动物发情性状[47]。

TSHR突变与家畜季节性繁殖有关，也深刻影响鸡的驯化特性[48]。TSHR突变可能通过改变血浆中甲状腺激素水平影响鸡的驯化特性，因此在家鸡进化过程中起重要作用[49-50]。有研究者通过对8个品种家鸡和野生红色原鸡的全基因组重测序，发现TSHR基因在鸡驯化过程中受到选择，并推测TSHR基因突变可能与鸡季节性繁殖相关[49,51]。随后，Karlsson等[41]针对TSHR基因使用红色原鸡(RJF-w/w)与白来航鸡(WL-d/d)作为研究对象，发现光照改变使d/d型母鸡TH水平发生变化，导致与w/w型母鸡相比，产蛋时间提早，卵巢更活跃。并且发现短光照下公鸡TSHR、TSHβ和DIO3的表达水平降低，导致睾丸缩小。揭示TSHR突变调控了鸡的季节性繁殖活动。以上结果均表明TSHR基因在禽类季节性繁殖调控中发挥重要作用。且TSHR基因调控禽类季节性繁殖机制与哺乳动物相似，长光照刺激禽类深层脑感光细胞[52-53]，进一步转化为神经内分泌反应，传递至PT区域，刺激PT表达TSHβ。TSHβ与下丘脑的TSHR结合诱导DIO2表达，DIO2促使T4转换为T3[38,53-54]。高浓度的T3导致LH和FSH的分泌增加，进而促进性腺生长[55]。

3.3 TSHR多态性与季节性繁殖的关系

目前，国外内研究者发现绵羊TSHR基因突变位点与季节性繁殖相关。窦立静等[6]在绵羊TSHR基因CDS区发现c.31A>G错义突变位点，分析表明该位点在不同繁殖特性(季节性繁殖和常年繁殖)绵羊群体的基因型和等位基因频率有明显不同的分布趋势，G等位基因与绵羊常年繁殖性状具有显著的相关性。该突变可能导致TSHR构象发生变化，使其与TSH的结合能力改变，进而影响繁殖机制下游，最终调控绵羊的季节性繁殖活动。Rubin等[51]深入研究发现鸡TSHR基因Gly558Arg位点是一个重要的错义突变，位于TSHR第4跨膜结构域与胞外loop交界处；Gly突变为Arg导致氨基酸由跨膜区移到胞外区，从而影响配体的结合。这个突变大约在1 100年前受到高强度选择，在现代鸡种中它几乎被固定为Arg[41,56]。Karlsson等[41,49]通过关联分析证明了Gly558Arg表型效应。Arg型比Gly型鸡产蛋性能更好、孵化期更短、神经敏感性和好斗性更低。轩俊丽等[8]发现绵羊TSHR基因外显子SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4个位点的多态性在乌珠穆沁羊和湖羊群体中存在极显著差异，SNP3、SNP4和 SNP5位点的改变均导致mRNA二级结构发生改变，致其表达和成熟异常，进而与繁殖性状变异相关。寸静宇等[9]和夏青等[10]检测了常年繁殖绵羊和季节性繁殖绵羊TSHR基因的共5个SNP位点，这5个位点基因型频率和等位基因频率在常年繁殖绵羊品种和季节性繁殖绵羊品种间差异均达到显著水平，表明TSHR基因及多态性与绵羊季节性繁殖性状具有较强的相关性。

4 结束语

综上可以看出，TSHR基因的研究已取得一定进展，TSHR基因结构、组织表达特性已基本明确。并且卵巢TSHR对动物卵巢功能调控以及下丘脑TSHR对绵羊及禽类季节性繁殖调控分子机制已经初步清晰。从现有的研究可以看出TSHR对动物季节性繁殖至关重要，相信随着进一步对TSHR在哺乳动物季节性繁殖调控中作用机制的研究，必将会解决绵羊季节性繁殖中存在的疑难问题，大大提高养羊效率。