GNβ3 C825T和NET T182基因多态性与儿童注意缺陷多动障碍相关性研究

梅 萍 张秋莹

学龄期(6～12岁)儿童处在身心发展的重要阶段，是心理以及行为发育趋于成熟的关键时期。注意缺陷多动障碍(Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD)是一种多见于学龄期儿童的精神障碍，该类型的儿童与其同龄正常儿童相比活动过度、注意力不集中，且常伴有学习成绩低下和冲动等行为[1]。目前ADHD的病因及发病机制尚不十分明确。文献报道称[2]儿童行为问题会受到遗传和环境因素共同影响，尤其是注意力分散、冲动等行为问题的发生可能更多地会受到遗传因素的影响。随着分子生物学的飞速发展，有关儿童行为问题候选基因的研究开始受到重视。研究发现[3]，G蛋白β3亚单位(G protein beta3 subunit，GNβ3) C825T基因与信号转导的增强和离子转运的活性相关，且介导的多个门控通道在精神障碍的发生中发挥重要作用，进一步研究发现[4]其通过调控G蛋白与重要的中枢性神经递质5-羟色胺耦联，调节腺苷酸环化酶或磷脂酶C，激活T细胞的蛋白激酶依赖的磷脂酶D途径，从而产生第二信使来对细胞活动进行调节，和精神分裂、人格以及情感等有密切关系。也有报道[4，5]称去甲肾上腺素转运体(Norepinephrine Transporter，NET)作为单胺类递质，也和人格分裂、攻击行为、精神障碍有关。研究表明[6]大部分NET需要通过细胞膜上的G蛋白耦联受体而产生生物学效应。因此本研究选择和人类情感、行为、认知等功能相关的GNβ3 C825T和NET T182作为候选基因，探讨基因多态性和ADHD的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2014年10月～2017年7月在湖北省随州市某小学募集的286例6～12岁ADHD患儿进行问卷调查，纳入标准：(1)符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSM-IV)[7]中ADHD的诊断标准；(2)3代内属本民族血缘；(3)取得患儿及家属或法定监护人的同意，并签署知情同意书。排除标准：患有儿童精神分裂症、情感障碍、孤独症、精神发育迟滞及其他器质性疾病者；家族中有精神疾病患者。所有儿童清水漱口后，采用一次性药匙对其口腔上皮进行采集，然后置于无水乙醇离心管中保存。其中男童132例，女童154例，平均年龄为(9.2±2.3)岁。

1.2 方法

1.2.1 儿童行为问题测评 采用Achenbach儿童行为量表(Child Behavior Checklist,CBCL)[8]对儿童行为问题进行检查，行为问题共120项(包括2个由教师自行填写内容的项目)，按0～2三级评分，包含品行问题、学习问题、心身障碍、多动指数、焦虑抑郁、注意力问题、社会化问题7个方面，将所有单项相加即为行为问题总分。参考苏林雁等[9]对湖南CBCL常模的研究结果，以常模总分第85百分位作为划界分，判断ADHD行为问题发生与否。

1.2.2 基因型分析 采用聚合酶链反应(PCR)和限制性片段内切酶法进行基因分析，其中引物设计采用的软件是primer 5.0，设施后输入美国国立图书馆数据库进行引物同源性比较，选出同源性最小且Tm最为合适的作为本研究PCR引物：(1)GNβ3 C825T基因型分析：引物序列：F:5’-TGACCCAACTTGCCACCCGTGC-3’，R:5’-GCAGCAGCCAGGGCTGGC-3’。反应体系为20 μl，加入基因组DNA 50 ng，引物10 pmol，1 U TapDNA聚合酶，2 μl 10×Buffer,2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs。反应条件为：94 ℃下预变性5 min，然后再在94 ℃下继续变性45 s，在60 ℃下退火30 s，在72 ℃下延伸45 s，共计30个循环，然后72 ℃下延伸10 min。最后将PCR产物中加入5 U的限制性内切酶BseD Ⅰ，然后在55 ℃温箱中进行消化，时间为3 h，最后在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，时间为3 h，通过硝酸银染色观察各区带。读取基因型：野生型(T/T)为342 bp的1条目的带；纯合突变(C/C)为126 bp和216 bp的2条目的带；杂合突变(T/C)为342 bp、126 bp和216 bp的3条目的带。(2)NET T182基因型分析：引物序列：F:5’-CTGTTGTGGCTGAAGTGTCGC-3’，R:5’-GGCTCTGCAGGATAAGCATTGAA-3’。反应体系为25 μl，加入基因组60 ng，上下游引物各0.2 μm，2.5 μl的10×Buffer, 2 U TapDNA聚合酶。反应条件：首先在94 ℃下预变性5 min，然后在94 ℃下变性30 s。接着在63 ℃下退火30 s，72 ℃延伸30 s，共计35个循环，最后在72 ℃下继续延伸10 min，12%聚丙烯酰胺电泳，时间为3 h，通过硝酸银染色观察各区带。读取基因型：20 bp和28 bp的2条目的带为野生型(C/C)；20 bp、28 bp和123 bp的3条目的带为杂合突变(C/T)；123 bp的l条目的带为纯合突变(T/T)。

1.2.3 统计学方法 数据录入采用双核查方式，分析采用软件SPSS 16.0，对群体数据进行Hardy-Weinberg定律的遗传平衡吻合度检验，通过t检验分析基因多态性对ADHD的影响，连续标量的计数资料采用平均值±标准差表示，组间比较采用t检验进行分析，采用广义估计方程模型(Generalized Estimating Equation,GEE)进行多因素分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡的吻合度检验 ADHD儿童进行GNβ3 C825T基因型和NET T182基因型Hardy-Weinberg平衡的吻合度检验，结果显示各观测值和期望值吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。见表1。

表1 GNβ3 C825T和NET T182基因基因型Hardy-Weinberg平衡的吻合度检验

2.2 GNβ3 C825T和NET T182基因多态性ADHD患儿CBCL评分比较 GNβ3 C825T基因CT/CC基因型CBCL焦虑抑郁、多动指数评分均高于TT基因型(P<0.05)。NET T182基因CT/CC基因型CBCL焦虑抑郁、社会化问题评分均高于TT基因型(P<0.05)。见表2。

表2 GNβ3 C825T和NET T182基因多态性ADHD患儿CBCL评分比较

2.3 GNβ3 C825T、NET T182与儿童ADHD影响因素的交互作用 文献报道[8]称ADHD儿童年龄、性别可能对心理行为存在影响，因此本研究以ADHD儿童行为发生与否作为因变量，将全部样本的GNβ3 C825T和NET T182基因多态性、性别以及年龄作为自变量进行Logisitic回归分析，结果显示GNβ3 C825T和NET T182基因多态性是焦虑抑郁的影响因素(P<0.05)，含C等位基因的个体更容易发生焦虑抑郁行为(P<0.05)。同时GNβ3 C825T基因多态性、性别是多动指数的影响因素(P<0.05)，且在含C基因个体中更容易发生多动行为(P<0.05)，男童比女童更容易发生多动行为(P<0.05)；NET T182基因多态性是社会化问题的影响因素(P<0.05)，且在含C基因个体中更容易发生社会化问题(P<0.05)。见表3、表4。

表3 GNβ3 C825T、性别、年龄与儿童ADHD影响因素的交互作用

表4 NET T182、性别、年龄与儿童ADHD影响因素的交互作用

3 讨论

研究表明[10]，编码G蛋白β3亚基的第10外显子上存在着C825T基因多态性，这种基因片段异性导致G蛋白β3亚基缺失41个氨基酸，从而产生变异，因G蛋白能够和80%已知的膜受体和效应器耦联，因此在扩膜运输过程中起着极其重要的作用。报道称[11]，GNβ3 C825T系统功能降低与心理、行为的变化有关。Jiang D等[12]发现，GNβ3 C825T基因与认知功能相关，启动子区-1438 A/G多态性与抑郁及冲动行为有关。Oakley M等[13]研究发现儿童多动行为的发生与C825T基因多态性存在明显相关。

本研究结果也显示ADHD儿童多动指数与C825T基因多态性存在相关性，且GNβ3 C825T基因多态性与性别存在交互作用，男童比女童更容易发生多动行为。儿童阶段为了适应现在以及未来社会生活，通过个人与社会的关系在家庭、学校等社会环境中获得思维、情感以及语言等能力的过程中所出现的问题是社会化问题，社会化问题可以在一定程度上反映儿童和外界沟通能力的强弱，也是儿童树立价值观和行为的准绳[14]。研究发现[15]，NET T182在调控人类情感及精神活动中发挥重要作用。另有报道称[16]，NET T182基因多态性和抑郁症、自杀观念、人格存在相关性，而这些也会影响机体与外界的交流。本研究结果显示NET T182基因中的C基因和社会化问题发生相关，但未发现与多动指数相关。国内学者王含彦等[17]通过Meta分析发现NET T182C基因多态性与抑郁症的发生之间存在关联，这可能也是引起儿童沟通能力变弱等社会化行为问题发生的原因。

焦虑抑郁主要是指面对内在想法感受或者外部事件的一种不愉快体验，严重者会发生恐怖、极端等行为[18]。文献报道[19]称焦虑和抑郁的产生会受到环境和基因两方面因素影响，儿童出现焦虑抑郁作为一种情绪表现，是环境和基因共同作用的结果。有学者[20]研究发现人格与人的神经和感知等密切相关，而GNβ3 C825T以及NET T182均和人格存在一定的关联性，本研究显示GNβ3 C825T和NET T182的基因多态性与ADHD儿童的焦虑抑郁存在相关。研究发现[21]，在细胞水平上，GNβ3 C825T多态性与Gi介导的信号转导改变有关，C-T转换导致跨膜信号转导和离子转运活性增强，从而在多种人类疾病中起重要作用。有学者发现[22]，在针对健康人的情绪及生活质量的研究中发现携带825T等位基因的抑郁症患者汉密尔顿抑郁量表评分增高，说明825T等位基因是抑郁的易感因素。NET位于神经末梢突触前膜，能够通过促进突触间隙的去甲肾上腺素(NE)进入突触前膜，从而阻碍NE与位于突触后膜的NE受体之间的相互作用，T182C位点的多态性可能影响到NET基因启动子的转录活性[23]，已有的研究表明[24]，NET T182C的等位基因C和基因型CC可能会增加抑郁症的发病风险，与本研究结果相符。

本研究对GNβ3 C825T和NET T182基因多态性与儿童ADHD相关性进行了分析，但本研究为单中心研究，且样本量较小，所以研究结果存在一定的局限性。研究发现[25]，GNβ3 C825T和NET T182基因多态性可能与民族、地域有关，且ADHD有多种分型，而GNβ3 C825T和NET T182基因多态性是否与这些因素有关仍有待进一步研究。

综上所述，GNβ3 C825T和NET T182基因可能是影响儿童行为问题的重要基因，GNβ3 C825T和NET T182与学龄儿童焦虑抑郁问题发生有一定关联，且NET T182与学龄儿童社会化问题也存在一定关联。目前，儿童行为问题的生物学证据是近年来研究的热点，环境和基因相互作用在儿童精神疾病中的作用越来越得到研究的证实。在过去几年，候选基因DRD4、DRD2、MAOA在儿童行为和人格、抑郁等问题中被广泛研究，基因和环境的相互作用越来越受到科学家的重视。因此以后研究需要结合更多候选基因，探讨基因和基因、基因和环境之间的相互作用。